沈燦章

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black–streaked dwarf virus，SRBSDV)作為一種新近流行的大范圍爆發(fā)的病毒受到人們廣泛的關(guān)注。有研究[1–5]表明，其病原基因組含10條片段，屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)、斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)。該病害在2001年首次發(fā)現(xiàn)，近年來，我國南方以及越南北部的水稻種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，尤其是2009年暴發(fā)成災(zāi)。到目前為止，中國已有35個(gè)省市以及越南有過該病害發(fā)生的報(bào)道。該病害危害的癥狀與20世紀(jì)60年代和90年代報(bào)道的水稻黑條矮縮病毒有所區(qū)別，其分布和流行區(qū)域相比普通水稻黑條矮縮病更易出現(xiàn)于中國南端。

1 典型癥狀

水稻黑條矮縮病在水稻各生育期均可感染，并且不同生長期都有其典型的癥狀，其癥狀表現(xiàn)為植株矮縮、葉色深綠、葉背及莖稈出現(xiàn)條狀乳白色或深褐色小突起、高位分蘗及莖節(jié)部倒生氣生須根，其中高位分蘗及莖節(jié)部氣生須根倒生這兩點(diǎn)有別于普通水稻黑條矮縮病的癥狀。觀察發(fā)現(xiàn)，高位分蘗和有倒生根癥狀的病株進(jìn)行多次重復(fù)的和帶有對照的RT–PCR檢測都是呈現(xiàn)SRBSDV陰性，表現(xiàn)莖稈上白色突起癥狀的病株都呈SRBSDV陽性，由此可見，高位分蘗和倒生根不是SRBSDV的典型癥狀，只有莖上白色突起才是南方水稻黑條矮縮病的獨(dú)特癥狀。由于水稻不同生育期都可以感染SRBSDV，并且可能出現(xiàn)不同病毒病或真菌病害混合侵染的情形，到目前為止還沒有一套完整的癥狀描述標(biāo)準(zhǔn)從癥狀上將SRBSDV與其他病害區(qū)分開來。本實(shí)驗(yàn)室研究顯示，SRBSDV癥狀易與普通黑條矮縮病RBSDV癥狀相混淆，即病株矮縮、病株葉頂端螺旋狀卷曲、病葉僵直扭曲、有不規(guī)則凸起或凹陷、發(fā)病嚴(yán)重的病株不抽穗，但感染SRBSDV的植株一般在莖節(jié)處有倒生根且莖上出現(xiàn)白色燭淚狀突起。另外，感染RBSDV的病株也有表現(xiàn)出類似于水稻黃矮病葉片發(fā)黃、分蘗伸展角度大、株形松散的癥狀。本課題組曾對一些呈現(xiàn)如葉尖旋迭、葉片螺旋、葉片上窗格狀皺縮、整葉螺旋緊裹、葉脈扭曲的癥狀的病株，用SRBSDV特異性專利引物多次重復(fù)下的RT–PCR檢測呈現(xiàn)陽性。而一些表現(xiàn)出SRBSDV癥狀如典型的窗格狀皺縮，有時(shí)并不是由于SRBSDV感染所致，也可能由藥害引起，如多效唑藥害。

2 寄主和傳播介體

周國輝等[3]報(bào)道南方水稻黑條矮縮病可危害水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、薏米(Coix chinensis)、稗草(Echinochloa crusgalli)、白草(Echinochloa crusgalli)和水莎草(Juncellus serotins)和異形莎草(Cyperus difformis)等多種作物與雜草。對采集于湖南省各地發(fā)病田塊附近禾本科作物及雜草的RT–PCR檢測中，發(fā)現(xiàn)SRBSDV可以感染高粱、野燕麥、牛筋草。自然感染該病害的寄主中玉米癥狀比較明顯，如矮縮、葉面皺褶和葉色深綠，而其他寄主癥狀不明顯。與RBSDV主要靠灰飛虱介體傳播不同的是，SRBSDV在自然條件下靠白背飛虱傳播，但室內(nèi)灰飛虱也能以較低的效率傳播，這也是SRBSDV與RBSDV在流行上最顯著的差別所在。也有研究[6–9]證實(shí)南方水稻黑條矮縮病毒不經(jīng)水稻種子傳播，這正好符合斐濟(jì)病毒屬染病植株的韌皮部，不能通過機(jī)械摩擦傳染的特征。目前主要認(rèn)可的傳毒介體為白背飛虱，由于白背飛虱的遷飛性，春季帶毒白背飛虱成為春季的初侵染源，經(jīng)過當(dāng)?shù)卦绲净蚱渌闹髦参锏姆敝常M(jìn)一步危害中晚稻，因此，被帶毒的白背飛虱侵染的水稻是下一代SRBSDV爆發(fā)的侵染源。

目前，SRBSDV的爆發(fā)情況與白背飛虱的流行狀況密切相關(guān)，防治條件必須立足于白背飛虱的防治。隨著SRBSDV新的寄主的發(fā)現(xiàn)，將能為預(yù)測病害流行和切斷白背飛虱的傳毒鏈，有效控制該病毒病的流行蔓延提供更多依據(jù)。

3 基因組序列

關(guān)于SRBSDV序列分析主要用于病原的鑒定和株系分類上的比較，以及進(jìn)一步研究該病毒的進(jìn)化和變異。目前已有廣東和海南以及越南的SRBSDV全序列測定，在與斐濟(jì)病毒屬內(nèi)其他病毒成員的全序列對比時(shí)發(fā)現(xiàn)，與其親緣關(guān)系最近的是與其核苷酸同一率達(dá)70%以上的水稻黑條矮縮病毒，其次是馬德里約柯托病毒和斐濟(jì)病病毒。在序列比對時(shí)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)各自基因組片段編碼功能的不同呈現(xiàn)出不同的同一性，與RBSDV相比，S1，S2 和 S10 相對保守，而S5和S6是最不保守的，這也說明了斐濟(jì)病毒科中各條片段是獨(dú)立進(jìn)化的。相對保守的片段功能一般關(guān)系到病毒的復(fù)制和適應(yīng)性，而相對多樣性的片段可能決定了病毒的寄主范圍及致病性。

有研究發(fā)現(xiàn)RBSDV的S6編碼沉默抑制子，也有在分析中發(fā)現(xiàn)S6是基因組片段中最不保守的，牛顏冰等[5]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)抑制分析法，證明了SRBSDV的S6編碼一個(gè)沉默抑制子具有抑制基因沉默的作用。利用昆蟲表達(dá)的桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其形成與病毒侵染時(shí)產(chǎn)生的相類似的微管結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證了生物信息預(yù)測到其具有自身互作的功能。所以，病毒進(jìn)化上各個(gè)片段的相對獨(dú)立性使得根據(jù)不同地理環(huán)境不同寄主上個(gè)別片段的差異來分析病毒的致病性和寄主的變化的關(guān)系成為可能。

4 病毒檢測技術(shù)

干擾SRBSDV識別的病毒主要是RBSDV，由于SRBSDV與RBSDV在癥狀、寄主范圍和傳播介體以及兩種病毒粒子在形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有相似性，使得一般的生物學(xué)和電鏡的觀察鑒定較為困難。

在血清學(xué)檢測上，前人研究[10–12]表明，用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)RBSDV S8和S9的編碼蛋白用Western blot可見到病株上相應(yīng)蛋白，制備RBSDV特異性抗血清用ELISA檢測到病株上的該病毒，為RBSDV的血清學(xué)快速檢測提供了條件。除此之外，還可以將血清學(xué)與PCR檢測的方法結(jié)合起來，如制備RBSDV 外殼蛋白的多克隆抗體建立了Dot–blot ELISA和免疫捕獲RT–PCR等檢測方法。為了增強(qiáng)血清學(xué)反應(yīng)的特異性，用來制備抗血清的免疫原必須盡可能的單一，在RBSDV的血清學(xué)檢測中，因?yàn)槠浜卸鄠€(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，用來制備抗血清使得其與多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白反應(yīng)，而且由于RBSDV外殼蛋白和表面突起的不穩(wěn)定性，很難提取完整的病毒粒子，所以要獲得高特異性的抗血清，通過原核表達(dá)病毒的特異性蛋白是必須的手段，SRBSDV全基因組序列的測定，對編碼蛋白質(zhì)的序列的獲得與分析為利用單個(gè)高含量且特異性的免疫原而獲得特異性抗血清提供了可能，但目前應(yīng)用于RBSDV上的血清學(xué)檢測技術(shù)由于因抗血清效價(jià)和特異性較低等問題并未廣泛應(yīng)用。

目前，SRBSDV 的檢測方法主要是RT–PCR，周國輝等[3]建立巢式RT–PCR檢測技術(shù)對SRBSDV進(jìn)行檢測，周倩等通過SRBSDV的S10序列設(shè)計(jì)引物能一步法RT–PCR快速檢測SRBSDV，相對減少了實(shí)驗(yàn)步驟，縮短了檢測時(shí)間。運(yùn)用RT–PCR對RBSDV的檢測也是比較常見的方法。季英華等[12]報(bào)道了一種加入3條引物只需一次RT–PCR ，即可實(shí)現(xiàn)對SRBSDV和RBSDV同時(shí)檢測與鑒別的方法?，F(xiàn)有研究報(bào)道顯示，開發(fā)基于YBR Green I的一步法檢測SRBSDV 的方法，其靈敏度較之傳統(tǒng)的RT–PCR方法提高了100倍。利用RT–LAMP技術(shù)能夠從來源于帶毒寄主和介體的提取的最低達(dá)1.2 × 10-6μg的總RNA中檢測出SRBSDV，并且可以區(qū)別于RBSDV，該技術(shù)使用方便，費(fèi)用低靈敏度高，適于運(yùn)用，但操作過程中要克服其環(huán)境中和實(shí)驗(yàn)器材上病毒核酸的污染。

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