Toll樣受體9與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的臨床特點(diǎn)相關(guān)性

史曉飛，王　可，樊琳琳，馬　新，付建斌

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，洛陽(yáng) 471003)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫中重要的病原體識(shí)別受體，通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)誘導(dǎo)免疫效應(yīng)分子表達(dá)，激活多種前炎性因子參與抗感染過(guò)程。新近研究認(rèn)為，TLRs與其相應(yīng)的特異性配體(包括內(nèi)源和外源性配體)結(jié)合，參與并調(diào)控特異性免疫應(yīng)答過(guò)程，在天然免疫和特異性免疫之間架起橋梁。因此，TLRs在自身免疫性疾病中的作用逐漸受到重視。家族成員Toll樣受體9(toll-like receptor 9，TLR9)能夠特異性識(shí)別內(nèi)源或外源DNA中非甲基化的CpG-DNA基序，啟動(dòng)炎性應(yīng)答信號(hào)通路，誘導(dǎo)自身抗體、炎性分子產(chǎn)生，引發(fā)炎性反應(yīng)和免疫效應(yīng)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定作用，近2年也成為研究熱點(diǎn)[1]。SLE是以自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞異?；罨?、產(chǎn)生致病性自身抗體和免疫復(fù)合物為主要特征的一種慢性炎性自身免疫病，病情復(fù)雜且診治困難，本文旨在通過(guò)了解TLR9表達(dá)與SLE臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，以期為TLR9用于疾病臨床診斷和病情監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

對(duì)象和方法

對(duì)象

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年12月至2011年3月門診和住院SLE患者48例，診斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分為SLE活動(dòng)期組(≥10分)和SLE非活動(dòng)期組(<10分)。

疾病對(duì)照組36例，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎15例，干燥綜合征12例，系統(tǒng)性硬化癥4例，肌炎皮肌炎5例。診斷均符合國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除合并感染、腫瘤等患者。

健康對(duì)照組為25名來(lái)自體檢中心的健康體檢者，抽血前1個(gè)月內(nèi)無(wú)感染史。

方法

細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD19+B淋巴細(xì)胞TLR9表達(dá)：(1)每例標(biāo)本取3支流式上樣管分別標(biāo)記A、B、C，各加入100 μl抗凝全血；A、B管加入PE標(biāo)記的鼠抗人CD19單克隆抗體(美國(guó)BD公司)，C管為空白對(duì)照，混勻、孵育。(2)加入紅細(xì)胞裂解液，混勻、孵育，離心、棄上清，PBS清洗。(3)加入預(yù)冷(4℃)固定液(Fix&Perm1，美國(guó)eBioscience公司)，孵育，PBS清洗。(4)加入破膜劑(Fix&Perm2)，輕微震蕩，孵育，PBS清洗。(5)A管加鼠抗人TLR9單克隆抗體(濃度5μgml，美國(guó)ALEXIS公司)，B管加入Mouse IgG1同型對(duì)照(美國(guó)ALEXIS公司)，混勻、孵育；C管加入0.5 ml PBS液重懸細(xì)胞，待測(cè)；A、B管PBS清洗，加羊抗鼠FITC熒光標(biāo)記Ⅱ抗(美國(guó)BD公司)，混勻、孵育；PBS清洗，加入0.5 ml PBS液重懸細(xì)胞，與C管同上機(jī)檢測(cè)分析。(6)應(yīng)用流式細(xì)胞儀FASCan進(jìn)行檢測(cè)，利用前向散射光和側(cè)向散射光以B淋巴細(xì)胞設(shè)門，對(duì)PE標(biāo)記的CD19細(xì)胞中結(jié)合FITC標(biāo)記的TLR9細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定每樣本門內(nèi)20 000個(gè)細(xì)胞；檢測(cè)結(jié)果用Cell Quest軟件進(jìn)行分析，記錄CD19+細(xì)胞TLR9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率。

血、尿常規(guī)、24 h尿蛋白定量、補(bǔ)體C3、紅細(xì)胞沉降率、抗雙鏈DNA抗體滴度測(cè)定等實(shí)驗(yàn)室資料采集按照我院常規(guī)方法測(cè)定。根據(jù)患者抽血前10 d內(nèi)出現(xiàn)的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，對(duì)SLE患者疾病活動(dòng)情況以SLEDAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)量化評(píng)分。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一般情況

SLE活動(dòng)期組27例，女25例，男2例，年齡為16～50歲，平均(30.2±8.9)歲。SLE非活動(dòng)期組21例，女19例，男2例，年齡為20～53歲，平均(32.1±9.6)歲。SLE活動(dòng)期組初發(fā)者15例，未使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療；復(fù)發(fā)者12例，抽血前潑尼松用量≤30 mgd，用藥時(shí)間≤1個(gè)月。

疾病對(duì)照組36例，女30例，男6例，年齡為21～58歲，平均(34.1±8.5)歲。健康對(duì)照組25名，年齡為19～55歲，平均(29.4±7.9)歲。

CD19+B淋巴細(xì)胞TLR9表達(dá)

SLE活動(dòng)期組外周血CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率高于非活動(dòng)期組、疾病對(duì)照組及健康對(duì)照組(均P<0.01)。SLE非活動(dòng)期組和疾病對(duì)照組CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率雖高于健康對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。SLE非活動(dòng)期組與疾病對(duì)照組CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

糖皮質(zhì)激素對(duì)SLE患者CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率的影響

SLE活動(dòng)期組中已用糖皮質(zhì)激素治療者外周血CD19+B細(xì)胞較未用藥者下降(P<0.05)，而應(yīng)用中小劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)TLR9在CD19+B細(xì)胞的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。

CD19+B淋巴細(xì)胞TLR9表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

SLE患者外周血CD19+B細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)率與SLEDAI評(píng)分(r=0.763)、抗雙鏈DNA抗體滴度(r=0.781)、紅細(xì)胞沉降率(r=0.712)呈正相關(guān)(均P<0.01)；與24 h尿蛋白(r=0.186)及血清補(bǔ)體C3水平無(wú)明顯相關(guān)(r=-0.326)(均P>0.05)。

表1外周血CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率

組　別例數(shù)CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率(%)SLE活動(dòng)期組2754 18±17 97?SLE非活動(dòng)期組2132 97±9 85疾病對(duì)照組3630 88±9 12健康對(duì)照組2529 75±7 49

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；TLR9：Toll樣受體9；*與SLE非活動(dòng)期組、疾病對(duì)照組、健康對(duì)照組比較，均P<0.01

表2SLE活動(dòng)期患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對(duì)CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率的影響

SLE活動(dòng)組例數(shù)CD19+B細(xì)胞CD19+B細(xì)胞TLR9表達(dá)率未用糖皮質(zhì)激素157 72±4 3259 78±20 84已用糖皮質(zhì)激素124 01±3 7946 98±14 22t—2 341 81P—0 0280 082

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；TLR9：Toll樣受體9

討　　論

迄今為止已發(fā)現(xiàn)10余種TLRs家族成員及其特異的TLR配體，不同成員在RA、干燥綜合征、硬皮病等自身免疫病中得到不同關(guān)注。其中TLR9因識(shí)別內(nèi)源或外源非甲基化CpG-DNA序列啟動(dòng)炎性應(yīng)答信號(hào)通路、激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1最終導(dǎo)致自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞活化，并誘導(dǎo)自身抗體和炎性分子產(chǎn)生，在SLE中的作用也受到越來(lái)越多的重視。

新近觀點(diǎn)提出，B細(xì)胞可以不依賴T細(xì)胞直接由免疫復(fù)合物(immune complex，IC)通過(guò)TLRs途徑激活參與自身免疫疾病的發(fā)病過(guò)程[2]，因此推測(cè)TLR9可能參與了SLE的發(fā)病過(guò)程。Leadbetter等[3]發(fā)現(xiàn)從MRL(lprlpr)狼瘡鼠模型中分離出來(lái)的B細(xì)胞經(jīng)包含CpG-DNA的IgG型IC刺激后能夠產(chǎn)生大量自身抗體，而這一過(guò)程需要B細(xì)胞抗原受體和細(xì)胞內(nèi)TLR9的協(xié)同作用。這一機(jī)制也能夠解釋Anders等[4]在MRL(lprlpr)狼瘡鼠活體實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用細(xì)菌CpG-DNA處理后，可以導(dǎo)致狼瘡鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量DNA自身抗體的現(xiàn)象。越來(lái)越多的資料顯示，TLR9的銜接作用可能是SLE中B細(xì)胞活化及自身抗體產(chǎn)生的新的潛在機(jī)制[5]。

本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了TLR9在SLE患者、非SLE的結(jié)締組織病患者及健康人外周血CD19+B淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平，并探討SLE患者疾病活動(dòng)狀態(tài)下外周血B細(xì)胞TLR9表達(dá)率情況。結(jié)果顯示，SLE病情活動(dòng)期TLR9表達(dá)顯著升高，提示B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9的激活與SLE及臨床病情活動(dòng)存在一定聯(lián)系。根據(jù)以往研究推測(cè)，SLE患者機(jī)體的免疫和炎性反應(yīng)都存在明顯異常，尤其是在病情活動(dòng)期，體內(nèi)出現(xiàn)高滴度自身抗體和大量免疫復(fù)合物[6]，從而提供更多促使TLR9途徑激活的CpG-DNA配體，并通過(guò)前述機(jī)制進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生與免疫細(xì)胞(包括自身反應(yīng)B細(xì)胞)分化成熟，分泌自身抗體和形成IC。因此，TLR9表達(dá)隨著疾病活動(dòng)度增高而上調(diào)，且其表達(dá)增高也反映出B細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)。同時(shí)，這一機(jī)制也能夠解釋外源性感染容易誘發(fā)SLE活動(dòng)的現(xiàn)象[7]，可能與細(xì)菌或病毒DNA侵入激活TLR9途徑有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于外周血B細(xì)胞TLR9表達(dá)情況尚存在爭(zhēng)議，Kiyoshi等[8]利用流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞TLR9在SLE患者表達(dá)上調(diào)，結(jié)果與本研究相似。李守新等[9]檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR9 mRNA水平發(fā)現(xiàn)，SLE患者較健康人表達(dá)降低，但這是基于TLR9轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，不等同于TLR9在蛋白水平的表達(dá)情況。

SLEDAI評(píng)分及抗雙鏈DNA抗體滴度等都是SLE疾病活動(dòng)性評(píng)定的常用指標(biāo)，對(duì)判斷疾病預(yù)后及臨床治療都具有較好的指導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TLR9的表達(dá)與兩者均具有正相關(guān)性，再次證實(shí)TLR9表達(dá)與SLE疾病活動(dòng)存在一定聯(lián)系；而其與補(bǔ)體C3水平無(wú)明顯相關(guān)性，可能是TLR9不影響補(bǔ)體系統(tǒng)激活途徑或者與樣本量有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者應(yīng)用小劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)外周血B細(xì)胞TLR9表達(dá)無(wú)明顯影響，其原因尚不清楚。雖然糖皮質(zhì)激素具有較強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用，且能夠通過(guò)抑制NF-κB所引起的一系列免疫和炎性反應(yīng)而發(fā)揮作用，但其作用機(jī)制廣泛且復(fù)雜，同時(shí)這些作用也隨劑量不同而異[10-11]。因此，是否由于劑量不足出現(xiàn)此現(xiàn)象，或者作為阻斷TLR9下游信號(hào)方式并不影響TLR9本身的表達(dá)，這些都還有待進(jìn)一步研究觀察。

綜上所述，TLR9介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與SLE的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可能與疾病活動(dòng)、器官功能損害等臨床特點(diǎn)存在一定相關(guān)性，因此可以通過(guò)外周B細(xì)胞TLR9的表達(dá)情況作為判斷SLE患者疾病活動(dòng)性及臨床預(yù)后的指標(biāo)之一。

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