楊喬木，謝春，閆博文，陳碩，王一非

(上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海，201418)

近年來中國的食品安全問題廣受關(guān)注。隨著人們對(duì)健康生活的日益追求，迫切需要安全和高效的天然抗菌劑來代替化學(xué)合成抗菌劑。天然抗菌劑需要具備抑制微生物初始數(shù)量和生長速率的雙重功能，既能作為食品添加劑直接加入到食品中，也能作為抗菌劑對(duì)食品的表面以及周圍的暴露環(huán)境進(jìn)行殺菌。

植物精油是一類由植物產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)，具有強(qiáng)烈氣味。有關(guān)精油抑菌性的研究始于近10年，這些研究囊括了數(shù)種精油對(duì)于食品腐敗菌的抑制作用，并且探究了其中抑菌效果較好的幾種精油的抑菌原理。精油在水溶液中具有良好的抑菌效果，但作為食品添加劑加入到食品中可能會(huì)影響食品本身的感官效果。解決這一問題的有效方法是利用精油蒸氣，既可以達(dá)到防腐保鮮的效果，又可以減少對(duì)食品感官的影響。

空氣離子發(fā)生器是一種使用高壓促使空氣分子電離，產(chǎn)生空氣離子的設(shè)備?？諝怆x子是空氣分子在光照、輻射、流動(dòng)氣體和水的作用下分解產(chǎn)生的。大多數(shù)商業(yè)離子發(fā)生器產(chǎn)生空氣負(fù)離子(negative air ions，NAI)。近年來，空氣負(fù)離子作為抗菌劑應(yīng)用于食品中，成為新的研究熱點(diǎn)。

1 精油蒸氣在離體條件下的抑菌活性研究進(jìn)展

1.1 精油蒸氣在離體條件下抑菌活性的測定方法

精油蒸氣在離體條件下的抑菌活性的研究尚未系統(tǒng)化，Lopez等(2005)采用圓盤揮發(fā)法，將浸漬了精油的圓紙片放在培養(yǎng)皿蓋中，然后將接種了試驗(yàn)菌的培養(yǎng)皿底板立刻倒扣在蓋子上，并用保鮮膜密封［1］。該方法的缺點(diǎn)是精油或精油蒸氣可能與培養(yǎng)皿材料相互反應(yīng)，或者密封不足導(dǎo)致蒸氣流失。Becerril等(2007)對(duì)此法做了改進(jìn)，在修改了的方法中，將5mL的瓊脂培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿蓋中，對(duì)整個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行密封，從而防止精油蒸氣吸附在塑料的培養(yǎng)皿蓋上［2］。Tyagi等(2011)使用“致死時(shí)間實(shí)驗(yàn)(kill time assays)”，將細(xì)菌暴露于某濃度的精油蒸氣中一段時(shí)間，隨后移除浸漬過精油的紙片，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察微生物的生長，從而確定精油蒸氣的動(dòng)態(tài)抑菌活性［3］。Caccioni等(1997)提出了一種不同的方法來研究活性分子在頂空、培養(yǎng)基表面和內(nèi)部之間的分配，他們設(shè)計(jì)了一種特殊的瓶蓋，瓶蓋內(nèi)部帶有小鋼鉤，小鋼鉤末端固定一個(gè)直徑6 mm的濾紙片，在容積為10mL的瓶子中裝入5mL接種了微生物的固體培養(yǎng)基，然后將瓶蓋蓋在瓶子上并密封。隨著時(shí)間的變化，通過頂空自動(dòng)氣相色譜儀，對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)(頂部空間和培養(yǎng)基之間)的分配動(dòng)態(tài)和微生物代謝物的產(chǎn)生等進(jìn)行分析［4-5］。

1.2 精油蒸氣的抑菌活性研究

研究者通過1.1的離體方法，發(fā)現(xiàn)多種精油蒸氣對(duì)多種細(xì)菌、霉菌和酵母具有抑菌活性。Nerin團(tuán)隊(duì)(2007，2005，2009)發(fā)現(xiàn)丁香、肉桂、百里香、牛至精油蒸氣對(duì)于細(xì)菌、真菌和酵母菌均有良好的抑制效果，而生姜，迷迭香等精油蒸氣的抑菌性略差［6-8］。Lopez等(2007)采用單滴微萃取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SDME，GC-MS)檢測精油蒸氣的成分隨時(shí)間的變化，并通過主要成分分析法確定香荊芥酚、百里香酚、肉桂醛為最有效的成分［9］。此外，Nedorostova等(2009)通過改進(jìn)的圓盤揮發(fā)法研究了27種精油蒸氣對(duì)5種食源性細(xì)菌的離體抑菌效果，發(fā)現(xiàn)含硫精油和百里香精油效果最好［10］。Goni等(2009)研究了肉桂和丁香精油蒸氣結(jié)合使用時(shí)對(duì)于4種革蘭氏陰性菌和4種革蘭氏陽性菌的抑制作用，并對(duì)2種成分之間的相加效應(yīng)、協(xié)同效應(yīng)和拮抗效應(yīng)加以確定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)(肉桂18～136 mg/L，丁香9～90 mg/L)，肉桂和丁香精油蒸氣的組合沒有協(xié)同效應(yīng)［8］。劉曉麗等(2010)比較了丁香精油、肉桂精油及混合精油蒸氣對(duì)供試細(xì)菌、霉菌和酵母菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)霉菌的抑菌作用明顯高于酵母菌和細(xì)菌，同時(shí)發(fā)現(xiàn)混合精油中的2種成分對(duì)細(xì)菌的抑制有拮抗作用，對(duì)酵母菌的抑制沒有影響，對(duì)Aspergillus flavu和A.nier有相加作用，對(duì)Penicillium citrinu有協(xié)同作用［11］。

1.3 精油蒸氣的抑菌機(jī)理研究

由于精油蒸氣的成分復(fù)雜，關(guān)于精油蒸氣的抑菌機(jī)理尚處于起步階段，其主要作用機(jī)制是對(duì)微生物細(xì)胞的多種破壞作用，主要起抑菌作用的成分為一些醛類和單萜烯類。Tyagi等(2010，2011)利用掃描電子顯微鏡，透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)微生物被精油蒸氣處理過后，細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞質(zhì)外泄現(xiàn)象更加明顯，細(xì)胞高度降低，細(xì)胞表面粗糙度顯著增加。他們還利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC-MS)和固相微萃取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME，GC-MS)對(duì)精油和精油蒸氣的成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)精油蒸氣中富含某種單萜烯［3，12-13］。一般認(rèn)為，抑菌物質(zhì)需要有效的成分和作用方式才能獲得好的抑菌效果，而蒸氣態(tài)下的抑菌分子可以與靶細(xì)胞直接作用，從而產(chǎn)生抑菌效果。蒸氣態(tài)分子具有較強(qiáng)的疏水性，同微生物的疏水性細(xì)胞膜有較強(qiáng)的吸引作用。當(dāng)精油分子溶解在固體或液體食品中時(shí)，它會(huì)與溶質(zhì)和離子相互作用，或多或少地被水分子包圍，降低了疏水性。而精油分子在蒸氣狀態(tài)的疏水性較之在水中時(shí)大大增強(qiáng)，且?guī)缀醪慌c水發(fā)生溶合，從而促使精油分子包絡(luò)、分割并穿透細(xì)胞［14］。因此，蒸氣態(tài)精油分子的抑菌活性更高。

精油蒸氣的抑菌效果還取決于微生物的種類和精油分子的蒸氣壓。革蘭氏陰性菌具有外膜(由脂多糖構(gòu)成)，可以防止外源物侵入細(xì)胞，因而對(duì)精油蒸氣有更好的抗性。此外，精油蒸氣的活性受到精油成分的化學(xué)性質(zhì)及其蒸氣壓的影響。Tyagi等(2010)發(fā)現(xiàn)在液態(tài)和蒸氣態(tài)時(shí)，檸檬草精油的活性大于薄荷醇精油，桉樹精油最差。這些精油的主要活性成分分別是檸檬醛、薄荷醇和1-8，桉葉素［12-15］。早期的研究表明，肉桂醛和檸檬醛等醛類蒸氣具有很強(qiáng)的抑菌活性，萜醇類(如薄荷醇)蒸氣的抑菌活性中等，酮式萜烯和萜醚類(如1-8，桉葉素)蒸氣的抑菌活性很差［16］。Caccioni等(1997)和 Gardinie 等(2011)均發(fā)現(xiàn)了頂部空間蒸氣壓會(huì)影響精油及其揮發(fā)性分子的抗真菌活性［4-5］。精油分子的蒸氣壓受到溫度和水分活度等環(huán)境因素影響，可以通過控制環(huán)境因素來提高其抑菌活性［5］。因此，只有聯(lián)系精油的物理狀態(tài)(蒸氣壓)，才能對(duì)精油蒸氣的抑菌性能做出更為系統(tǒng)的評(píng)估。

2 精油蒸氣在食品保藏中的應(yīng)用

目前，精油蒸氣較多地與各種食品包裝結(jié)合使用，該法最大的優(yōu)點(diǎn)是將精油蒸氣應(yīng)用在食品包裝中，避免抗菌劑集中在食品表面，既減少對(duì)食品感官的影響，又不妨礙食品的食用。植物精油及其組成成分屬于天然提取物，依據(jù)歐盟決議2002/113/EC被分類到香料，在美國被美國食品與藥品管理局(FDA)認(rèn)證為GRAS物質(zhì)，具有較高的食用安全性，但由于其成分復(fù)雜，很難制定針對(duì)于精油的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。歐洲議會(huì)和理事會(huì)頒布的指令2004/1935/EC規(guī)定，每一種從包裝中遷移到食品中的物質(zhì)都須符合食品添加劑通用指令89/107/EEC。因此，凡是符合2004/1935/EC相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)精油活性包裝均可投入商業(yè)使用。此外，歐盟(EC)No 1334/2008法案規(guī)定禁止向食品中直接添加胡薄荷酮，異茴香醚，豆香素等芳香物質(zhì)，因此對(duì)于含有以上成分的精油應(yīng)限制其應(yīng)用。我國GB9685-2008《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)于食品容器、包裝材料用添加劑的使用亦做出了具體規(guī)定。

食品包裝中，選擇合適的基質(zhì)成膜，對(duì)提高精油蒸氣的抑菌性能非常重要，因?yàn)閾]發(fā)性物質(zhì)在薄膜中釋放的水平會(huì)受到聚合物基質(zhì)的顯著影響。Nerin團(tuán)隊(duì)促進(jìn)了抑菌包裝的發(fā)展，使其達(dá)到了與離體試驗(yàn)相似的抑菌水平。Lopez等(2007)發(fā)現(xiàn)混合了肉桂精油或牛至精油的聚丙烯(PP)薄膜較聚乙烯/乙烯-乙烯醇共聚物(PE/PVOH)薄膜具有更好的抗真菌性能，進(jìn)一步的遷移實(shí)驗(yàn)證明，這樣的食品包裝符合2002/72/EC 的規(guī)定［6］。Rodriguez等(2007)發(fā)現(xiàn)，在富含肉桂醛的肉桂精油涂層紙包可以阻止蒸氣滲漏并防止真菌污染［17］。此外，涂層中活性成分的濃度以及活性成分的表面濃度也是影響包裝抑菌性的關(guān)鍵因素。Rodriguez等(2008)評(píng)估了以肉桂為基本成分的固體蠟活性包裝對(duì)面包的保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)6%的肉桂精油可以完全抑制Rhizopus stolonifer［18］。此外，精油蒸氣與氣調(diào)包裝相結(jié)合可以延緩甜櫻桃和葡萄等多種水果的貨架品質(zhì)［19-21］。

精油蒸氣可以在不與表面直接接觸的情況大范圍地作用于產(chǎn)品，從而使暴露于其中的產(chǎn)品不易腐敗。將水果在儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間直接暴露于精油蒸氣中，不但能降低水果在顏色和香味方面的感官影響，還能給予水果抑菌性保護(hù)。Wang等(2003)將采摘下的覆盆子和獼猴桃與精油蒸氣直接接觸，發(fā)現(xiàn)其易腐性顯著降低［22］。Tzortzakis(2007)將水果(草莓和番茄)在儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間暴露于桉樹/肉桂精油蒸氣中，在保證水果的顏色和香味不受影響的前提下，起到了很好的防腐保鮮效果［23］。

3 空氣負(fù)離子的抑菌活性研究進(jìn)展

空氣負(fù)離子對(duì)食品腐敗菌的抑菌研究尚處在起步階段。盡管早期研究發(fā)現(xiàn)帶電的空氣負(fù)離子對(duì)P.notatum，Neurospora crassa，Serratiamar cescens和Staphylococcus albus的生長有抑制作用［24-27］，但是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的不統(tǒng)一，有關(guān)空氣負(fù)離子抑菌作用的研究進(jìn)展十分緩慢。直到1990年代后期，人們才利用更新、更系統(tǒng)的策略來確定空氣負(fù)離子的抑菌活性。Shargawi等(1999)將接種了Candida albicans的瓊脂培養(yǎng)基暴露在連接有空氣負(fù)離子發(fā)生器的真空灌中，發(fā)現(xiàn)在O3存在的情況下空氣負(fù)離子的抑菌效果更好。因此他提出在空氣離子化過程中，氧化劑和超氧離子自由基的存在是空氣負(fù)離子抑制微生物活性的重要原因［28］。Fletcher等(2007)將7種細(xì)菌暴露在空氣負(fù)離子中，發(fā)現(xiàn)其中6種細(xì)菌細(xì)胞死亡的原因是暴露在 O3中，只有 Mycobacterium parafortuitum是由于暴露在電場中產(chǎn)生電穿孔而死亡［29］。Fan等(2002)同樣發(fā)現(xiàn)空氣負(fù)離子和O3具有良好的協(xié)同效應(yīng)［30］。

空氣負(fù)離子的抑菌機(jī)理研究還處于早期階段，其主要作用機(jī)制是對(duì)細(xì)胞的破壞作用。細(xì)菌細(xì)胞的表面性質(zhì)和生理?xiàng)l件(如生長環(huán)境、菌齡和環(huán)境的應(yīng)激因素)，均能影響空氣負(fù)離子的抑菌活性。Digelet(2004)利用十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)提出，氫氧根離子聚集在細(xì)菌表面導(dǎo)致細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)被等離子束破壞，最終使細(xì)菌死亡［31］。Tyagi等(2008)發(fā)現(xiàn)空氣負(fù)離子對(duì)Escherichia coli和Pseudomonas fluorescens的抑菌效果與它們的生理狀態(tài)以及與空氣負(fù)離子的空間關(guān)系有關(guān)［32］。Fan等(2006)亦報(bào)道了空氣負(fù)離子對(duì)于蘋果片和綠豆等食品基質(zhì)上的病原菌的抑菌效果［33］。這些研究建立了空氣負(fù)離子在現(xiàn)實(shí)生活中應(yīng)用的平臺(tái)。

4 空氣負(fù)離子在食品保藏中的應(yīng)用

空氣負(fù)離子能在空氣消毒、病害防治和食品加工等行業(yè)發(fā)揮作用。靜電電荷系統(tǒng)(electrostatic space charge system，ESCS)能顯著減少不銹鋼表面的微生物負(fù)荷，有望成為許多食品/禽類制品加工領(lǐng)域的補(bǔ)充處理技術(shù)。以正負(fù)離子的應(yīng)用為基礎(chǔ)的新型空氣凈化和殺菌技術(shù)(等離子束技術(shù))在近幾年有了很大發(fā)展［34-36］。介質(zhì)阻擋光柵放電，使呈煙霧狀散開的細(xì)菌短期暴露，正是這種直接的暴露使得空氣中的細(xì)菌顯著減少。蔡蕊(1999)通過環(huán)境隔離柜的方法來確定空氣負(fù)離子器是否能通過減少環(huán)境控制隔離柜中空氣灰塵和其他粒子的含量來影響腸炎沙門氏菌的空氣傳播，最終結(jié)果表明放置離子器的組中菌的傳播較之未放置離子器的組有所減少［37］。其他研究還發(fā)現(xiàn)，空氣負(fù)離子的存在使得空氣中的粉塵、其他顆粒性物質(zhì)和后續(xù)沉淀帶電，從而減少了細(xì)菌在空氣中的傳播［38］。

空氣負(fù)離子發(fā)生器在預(yù)防果蔬腐爛和減少環(huán)境微生物上有巨大的潛能，但是真正要實(shí)現(xiàn)商業(yè)化運(yùn)用，還存在一定缺陷［39］。高濃度的空氣負(fù)離子能抑制微生物的活性，但不同的微生物對(duì)該系統(tǒng)的應(yīng)答也各不相同［40］。而且，空氣負(fù)離子發(fā)生器能引起電離器自身鄰近表面和接地部件處潛在感染性顆粒的積累，甚至造成一些病害的局部爆發(fā)［41］。因此，空氣離子應(yīng)當(dāng)與其他抗菌劑結(jié)合使用，才能更有效的進(jìn)行食品的防腐保鮮。

5 精油蒸氣結(jié)合空氣負(fù)離子的抑菌活性研究進(jìn)展

精油蒸氣和空氣負(fù)離子結(jié)合使用時(shí)，不但抑菌活性更高，而且都可以不接觸食品，從而把對(duì)食品品質(zhì)的影響也降低到最低。這種結(jié)合最初是通過精油蠟燭中釋放出來的擴(kuò)散性電離產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)的［42］。在蠟燭產(chǎn)生的活性揮發(fā)電離產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了橙皮油和百里香油，它們單獨(dú)使用時(shí)幾乎沒有抑菌性，但與空氣負(fù)離子結(jié)合時(shí)具有協(xié)同作用［43］，這項(xiàng)新技術(shù)可以顯著降低物質(zhì)表面的細(xì)菌總量［44］。

空氣負(fù)離子能提高精油蒸氣對(duì)微生物細(xì)胞的殺死作用?？諝庳?fù)離子由自由電子組成，自由電子與氧反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基再與精油的主要揮發(fā)性成分相互作用，從而增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使得更多的細(xì)菌被殺死。Gaunt等(2005)發(fā)現(xiàn)空氣負(fù)離子可以覆蓋細(xì)菌的液膜，促進(jìn)離子化精油分子的轉(zhuǎn)移，并加強(qiáng)細(xì)胞膜間的聯(lián)系［44］。Tyagi等(2010)報(bào)道了精油蒸氣與空氣負(fù)離子結(jié)合可以抑制P.fluorescens，延長冷藏果蔬的貨架期［12］。4種精油(香茅、野薄荷、歐薄荷、藍(lán)桉)分別與空氣負(fù)離子結(jié)合，均能有效抑制液體或氣體中的P.fluorescens。電子顯微鏡掃描結(jié)果顯示，與精油蒸氣或空氣負(fù)離子單獨(dú)處理相比，空氣負(fù)離子與香茅蒸氣或者薄荷蒸氣相結(jié)合處理時(shí)的效果最好，4 h內(nèi)P.fluorescens的細(xì)胞質(zhì)全部流失，而空氣負(fù)離子單獨(dú)處理時(shí)細(xì)胞只出現(xiàn)局部變形;此外，空氣負(fù)離子與檸檬草油蒸氣結(jié)合使用時(shí)，對(duì)E.coli的抑菌性比單獨(dú)使用空氣負(fù)離子或者單獨(dú)使用精油蒸氣時(shí)的效果好［45］。

6 結(jié)論和未來展望

精油蒸氣對(duì)一些食品中的微生物具有較好的殺菌作用，通過活性、改性氣體包裝或熏蒸劑進(jìn)行水果防腐保鮮的應(yīng)用前景非常看好，同時(shí)精油蒸氣亦可減少生鮮產(chǎn)品在保溫工具箱、紙板箱、盒子等商業(yè)環(huán)境中的腐敗變質(zhì)。在美國，通常認(rèn)為精油或其成分都是安全的，歐洲法規(guī)也制定了明確的使用規(guī)則。亟待解決的是精油蒸氣對(duì)食品感官的影響。

空氣負(fù)離子作為抗菌劑的穩(wěn)定性能和作用機(jī)理通過過去20年的研究已經(jīng)初步明確。在防止果蔬腐敗和醫(yī)院或動(dòng)物聚集地的感染性傳播方面的應(yīng)用前景也被看好。實(shí)驗(yàn)室的大規(guī)模研究也表明，精油蒸氣暴露于空氣負(fù)離子的情況下抑菌活性顯著提高。開發(fā)空氣負(fù)離子-精油蒸氣設(shè)備，將會(huì)促進(jìn)廉價(jià)，環(huán)保和高效的食品包裝技術(shù)和空氣凈化技術(shù)的發(fā)展。

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