楊 陽(yáng)，段維勛，王 寧，梁振興，姜 鵬，周 建，金振曉，易定華

·基礎(chǔ)研究·

γ-分泌酶抑制劑對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的作用

楊 陽(yáng)，段維勛，王 寧，梁振興，姜 鵬，周 建，金振曉，易定華

目的γ-分泌酶抑制劑（DAPT）是Notch信號(hào)通路特異性阻斷劑，本實(shí)驗(yàn)將研究DAPT對(duì)SD大鼠離體心臟缺血再灌注損傷（I/RI）的影響，為探明Notch信號(hào)通路在心肌I/RI中的作用提供理論依據(jù)。方法采用離體大鼠心臟Langendorff逆行灌注模型，缺血50 min，再灌注60 min。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為正常對(duì)照組（Control）、I/RI組、DAPT（1 μM）+I/RI組，DAPT（1 μM）組。監(jiān)測(cè)缺血前后血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，包括：心率（HR）、左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室內(nèi)壓最大變化速率（+dp/dtmax）、冠脈流量（CF）、計(jì)算出心率壓力指數(shù)（DP，LVDP×HR/1000）；氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法測(cè)定各組心肌梗死（MI）的面積；專用試劑盒測(cè)定冠脈流出液（CF）中乳酸脫氫酶含量（LDH）。結(jié)果與Control組比較，I/R組缺血后各時(shí)間點(diǎn)的收縮及舒張功能均顯著降低（P＜0.01），MI面積顯著增加（P＜0.01），冠脈流出液中LDH含量顯著升高（P＜0.01）；與I/RI組比較，DAPT+I/RI組可以加重上述指標(biāo)進(jìn)一步惡化（P＜0.01）；與Control組比較，DAPT各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論DAPT有加重心肌缺血再灌注損傷的作用，Notch信號(hào)通路可能在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

γ-分泌酶抑制劑；離體大鼠心臟；缺血再灌注損傷；心肌保護(hù)

心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，I/RI）是缺血性心肌病和體外循環(huán)心臟手中過(guò)程中十分常見(jiàn)的病癥，其病理機(jī)制復(fù)雜，有很多信號(hào)通路和細(xì)胞因子參與其中［1-4］。Notch信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育、病理和生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5］。研究提示Notch信號(hào)通路可能在心肌梗死后心肌保護(hù)中發(fā)揮調(diào)控作用［6-7］，而Notch信號(hào)通路在心肌急性I/RI中的研究尚無(wú)報(bào)道。γ-分泌酶抑制劑（DAPT）是Notch信號(hào)通路特異性阻斷劑，研究顯示DAPT可以有效的抑制Notch信號(hào)通路［8-9］。研究指出血流動(dòng)力學(xué)降低、心肌梗死（MI）面積增加和乳酸脫氫酶（LDH）釋放增多是心肌I/RI的重要的病理特征［2，10-11］。因此，血流動(dòng)力學(xué)、MI面積和LDH釋放量可以作為反映心肌損傷程度的重要指標(biāo)。本研究將以SD大鼠離體灌注心臟作為研究對(duì)象，觀察DAPT對(duì)心肌I/RI的影響，為探明Notch信號(hào)通路在心肌I/RI中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 成年Spragure-Dawley大鼠，雄性，220～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 DAPT（Santa Cruz公司，美國(guó)），2，3，5-氯三苯四唑（Sigma公司，美國(guó)），LDH檢測(cè)試劑盒（南京建成公司，中國(guó)）。Langendorff離體心灌注系統(tǒng)（Radnoti公司，美國(guó)），MP100壓力換能器（Biopac Systems公司，美國(guó)）。

1.3 離體心臟灌注模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)文獻(xiàn)［12］所述，Langendorff系統(tǒng)采用經(jīng)典的KH液灌裝，KH緩沖液成分（mmol/L）：NaCl 118、KCl 4.7、CaCl21.25、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325及葡萄糖5.5。灌流前50 min，以體積分?jǐn)?shù)為95%的O2和5%的CO2混合氣體向儲(chǔ)液罐內(nèi)的灌流液中持續(xù)通氣，灌流液的溫度維持在37℃，pH維持在7.35～7.45。SD大鼠腹腔注射戊巴比妥（30 mg/kg）和肝素（500 U/kg），大鼠麻醉后，迅速開(kāi)胸取心臟，立即放入預(yù)冷的KH緩沖液（4℃）。將主動(dòng)脈根部迅速固定于灌注管口，于37℃下用KH液逆行恒壓灌注（灌注壓為80 mm Hg）。心臟復(fù)跳后，于左心耳處剪一小口，將帶有乳膠水囊的測(cè)壓管經(jīng)二尖瓣插入左心室。連接壓力換能器，調(diào)節(jié)水囊使左心室舒張末壓為5～10 mm Hg左右，心臟穩(wěn)定灌注10 min，待心跳穩(wěn)定后記為灌注開(kāi)始，按分組進(jìn)行灌注。

32只SD大鼠隨機(jī)分為4組（n＝8），即空白對(duì)照（Control組）、I/RI組、DAPT（1 μM）+I/RI組，DAPT（1 μM）組。采用離體大鼠心臟Langendorff逆行灌注模型，各組均穩(wěn)定灌注10 min。10 min后，Control組用KH液灌注直至120 min；I/RI組停止灌注50 min，然后用KH液再灌注直至120 min；DAPT（1 μM）+I/RI組穩(wěn)定后用含有1 μM DAPT的KH液灌注10 min，然后缺血50 min，再用正常KH液灌注至120 min；DAPT組不停止灌注，穩(wěn)定后用含有1 μM DAPT的KH液灌注10 min，然后換正常KH液灌注至120 min。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 采用MP100換能器記錄心臟缺血前及再灌注后15 min、30 min、45min及60 min時(shí)的心率（HR）、左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室內(nèi)壓最大變化速率（+dp/dtmax），并計(jì)算出心率壓力指數(shù)（DP，LVDP×HR/1000）。收集這些時(shí)間點(diǎn)的冠脈流出液，并記錄冠脈流量（CF）。

1.5 心肌梗死面積的TTC染色法檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)［12］所述，心臟處理完畢后于-70℃冷凍10 min，繼之沿心臟長(zhǎng)軸切成橫切面1～2 mm的切片，每個(gè)心臟取直徑最長(zhǎng)的一片。切片在TTC及0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中孵育30 min（pH調(diào)整至7.4，溫度37℃），再置于40 g/L的甲醛中固定過(guò)夜，并行數(shù)碼攝影。用linage J 1.37軟件行圖像分析，顯磚紅色者為正常區(qū)域，顯灰白色者為梗死區(qū)域。梗死面積由總壞死區(qū)占總切片區(qū)的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。

1.6 冠脈流出液中LDH檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)［12］所述，留取各組第75 min時(shí)冠脈流出液，LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)流出液中LDH含量，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，比較二組間差異用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及描記圖 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：與I/R組比較，DAPT+I/R組復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)的LVDP、+dp/dtmax以及DP都明顯降低（P＜0.01）；與Control組相比，DAPT組在加藥10 min內(nèi)心率減慢，而LVDP、+dp/dtmax升高（P＜0.01），藥物去除后，心臟LVDP和+dp/dtmax逐漸恢復(fù)到正常水平，各項(xiàng)指標(biāo)與Control組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1和表1。

2.2 MI面積的測(cè)定 TTC染色方法檢測(cè)結(jié)果顯示：與I/R組比較，DAPT+I/R組MI面積明顯增加（P＜0.01）；與Control組比較，DAPT組MI面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 各組冠脈流出液中LDH檢測(cè)結(jié)果 LHD檢測(cè)結(jié)果顯示：與I/R組比較，DAPT+I/R組LDH水平明顯增加（P＜0.01）；與Control組比較，DAPT組LDH水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

表1 各組心臟血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果（n＝8，±s）

表1 各組心臟血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果（n＝8，±s）

注：R：再灌注；與Control組比較?P＜0.01；與I/RI組比較＃P＜0.01。

組別項(xiàng)目（min）HR（beats/min）LVDP（mm Hg）+dP/dtmax（mm Hg/s）DPCF（ml/min）Control組10295.3±5.197.2±3.11962±7228.70±0.1012.82±0.64 75290.2±7.395.2±4.31922±9227.56±0.0812.57±0.55 90288.3±5.792.7±5.01879±10826.24±0.1212.33±0.59 105280.0±5.889.2±4.71805±11624.86±0.1411.86±0.50 120275.5±5.587.8±4.51779±9823.91±0.1711.24±0.72 IR組10296.2±5.595.5±2.11957±6428.31±0.1312.91±0.50 75（R15）279.2±6.2?56.3±4.2?1153±108?15.25±0.08?10.52±0.45?90（R30）272.5±5.3?48.7±4.3?991±89?12.21±0.06?8.36±0.53?105（R45）264.9±5.8?40.9±4.9?835±105?10.65±0.12?8.28±0.61?120（R60）260.1±6.5?36.6±4.2?754±98?9.51±0.11?7.85±0.63?DAPT+IR組10298.4±4.798.6±6.31967±6628.42±0.1412.93±0.42 75（R15）270.2±5.5?＃42.0±5.0?＃835±87?＃11.43±0.15?＃8.17±0.51?＃90（R30）268.0±6.4?＃40.2±5.7?＃802±115?＃10.84±0.10?＃7.58±0.65?＃105（R45）262.5±5.7?＃33.7±6.5?＃664±96?＃8.72±0.12?＃7.26±0.59?＃120（R60）262.4±5.4?＃27.2±6.2?＃547±90?＃7.15±0.13?＃7.11±0.5?＃DAPT組10297.9±5.896.5±3.71978±5228.32±0.0812.93±0.36 75289.6±6.890.7±6.81856±10226.33±0.1612.77±0.54 90284.5±7.593.0±7.21903±8426.82±0.1312.16±0.44 105282.5±5.687.3±6.6＃1785±92＃24.70±0.17＃12.02±0.64 120280.3±6.386.9±5.9＃1781±75＃23.89±0.13＃11.39±0.56

圖1 DAPT對(duì)離體心臟LVDP影響的描記圖

圖2 TTC染色測(cè)定各組MI面積

圖3 各組冠脈流出液中LDH水平檢測(cè)

3 討 論

缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）是危害人類健康的第一殺手，我國(guó)現(xiàn)有患者超過(guò)2 000萬(wàn)人，且每年新增100萬(wàn)人左右，其治療的核心就是重新恢復(fù)心肌血液供應(yīng)，但缺血心肌組織重新恢復(fù)血液供應(yīng)（再灌注）后常繼發(fā)和加重心肌組織損傷，即心肌I/RI［1］，常導(dǎo)致患者死亡、預(yù)后不良、嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生，是IHD臨床治療效果不佳的主要原因之一。心肌I/RI的病理機(jī)制復(fù)雜，有很多信號(hào)通路和細(xì)胞因子參與其中［1-4］。研究提示Notch信號(hào)通路可能在心肌梗死后心肌保護(hù)中發(fā)揮調(diào)控作用［5-7］，而Notch信號(hào)通路在心肌急性I/RI中的研究尚無(wú)報(bào)道。DAPT是一種γ-分泌酶抑制劑，研究顯示DAPT可以有效的抑制Notch信號(hào)通路［8-9］。LDH廣泛存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)酶釋放到細(xì)胞外，使血清酶升高，故LDH的檢測(cè)可作為心肌損傷診斷方法［10-11］。

本研究結(jié)果顯示：DAPT可以加重離體心臟I/RI，表現(xiàn)為心臟血流動(dòng)力學(xué)減弱、心肌梗死面積增加、冠脈流出液中LDH釋放量增加。由此，我們推測(cè)：Notch信號(hào)通路的完整對(duì)減弱心肌I/RI有重要作用。本研究為Notch信號(hào)通路參與調(diào)控心肌I/RI過(guò)程提供了理論依據(jù)，有利于尋找全新藥物作用靶點(diǎn)對(duì)心肌I/RI的主要作用環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，對(duì)于獲得全新的心肌保護(hù)方法提供了新的思路。

［1］Botker HE，Kharbanda R，Schmidt MR，et al.Remote ischaemic conditioning before hospital admission，as a complement to angioplasty，and effect on myocardial salvage inpatients with acute myocardial infarction：a randomised trial［J］.Lancet，2010，375（9716）：727-734.

［2］Kleinbongard P，Schulz R，Heusch G.TNFα in myocardial ischemia/reperfusion，remodeling and heart failure［J］.Heart Fail Rev，2011，16（1）：49-69.

［3］楊陽(yáng)，段維勛，金振曉，等.姜黃素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)氧化氫損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］.中國(guó)體外循環(huán)雜志，2011，9（4）：239-242.

［4］楊陽(yáng)，段維勛，周京軍，等.γ-分泌酶抑制劑對(duì)正常乳鼠心肌細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)體外循環(huán)雜志，2011，9（2）：89-92.

［5］Nemir M，Pedrazzini T.Functional role of Notch signaling in the developing and postnatal heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45（4）：495-504

［6］Oie E，Sandberg WJ，Ahmed MS，et al.Activation of Notch signaling in cardiomyocytes during post-infarction remodeling［J］.Scand Cardiovasc J，2010，44（6）：359-366.

［7］Gude NA，Emmanuel G，Wu W，et al.Activation of Notch-Mediated Protective Signaling in the Myocardium［J］.Circ Res，2008，102（9）：1025-1035.

［8］Subramaniam D，Ponnurangam S，Ramamoorthy P，et al.Curcumin Induces Cell Death in Esophageal Cancer Cells through Modulating Notch Signaling［J］.PLoS One，2012，7（2）：e30590.

［9］Mori M，Miyamoto T，Yakushiji H，et al.Effects of N-［N-（3，5-difluorophenacetyl-L：-alanyl）］-S-phenylglycine t-butyl ester（DAPT）on cell proliferation and apoptosis in Ishikawa endometrial cancer cells［J］.Hum Cell，2012，25（1）：9-15.

［10］Zhang L，Ma J，Liu H.Protective Effect of Ischemic Postconditioning against Ischemia Reperfusion-Induced Myocardium Oxidative Injury in IR Rats［J］.Molecules，2012，17（4）：3805-3817.

［11］Wang N，Min X，Li D，et al.Geranylgeranylacetone protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high-mobility group box 1 protein in rats［J］.Mol Med Report，2012，5（2）：521-524.

［12］Duan W，Yang Y，Yan J，et al.The effects of curcumin posttreatment against myocardial ischemia and reperfusion by activation of the JAK2/STAT3 signaling pathway［J］.Basic Res Cardiol，2012，107（3）：1-12.

體外循環(huán)學(xué)會(huì)會(huì)議通知

第6屆全國(guó)體外循環(huán)學(xué)術(shù)會(huì)議暨首屆亞太體外生命支持學(xué)術(shù)會(huì)議，會(huì)議簡(jiǎn)稱：APELSO 2013（The 6th National Meeting of Extra-Corporeal Circulation and The 1st Conference of Asia-Pacific Chapter of Extracorporeal Life Support Organization），將于2013年10月11日至13日在北京國(guó)際會(huì)議中心舉辦。此會(huì)也是ECMO國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議首次在我國(guó)舉辦。大會(huì)將邀請(qǐng)ECMO開(kāi)拓者、ELSO創(chuàng)始人Robert Bartlett教授及現(xiàn)任ELSO主席、AmSECT主席以及歐洲和亞太地區(qū)ECMO治療中心的首席專家來(lái)分享他們?cè)贓CMO領(lǐng)域的豐富經(jīng)驗(yàn)。會(huì)前將舉辦現(xiàn)場(chǎng)ECMO模擬培訓(xùn)。

此次盛會(huì)恰逢體外循環(huán)分會(huì)成立及《中國(guó)體外循環(huán)雜志》創(chuàng)刊十周年，屆時(shí)將舉辦隆重的慶?；顒?dòng)。會(huì)議詳細(xì)信息請(qǐng)?jiān)L問(wèn)會(huì)議網(wǎng)站（http：//cn.apelso2013.chinacpb.com/或http：//apelso2013.chinacpb.com/）或中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)體外循環(huán)學(xué)會(huì)網(wǎng)站（http：//www.chinacpb.com/）。

2013年4月舉辦“全國(guó)ECMO學(xué)習(xí)班”，為期2～3天，地點(diǎn)：暫定北京阜外醫(yī)院。

Effects of γ-secretase inhibitor on isolated rat heart induced by ischemia reperfusion injury

Yang Yang，Duan Wei-xun，Wang Ning，Liang Zhen-xing，Jiang Peng，Zhou Jian，Jin Zhen-xiao，Yi Ding-hua
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Shaan＇xi Xi＇an 710032，China

ObjectiveDAPT is a specific inhibitor of Notch signaling pathway，our study investigated the effects of DAPT on isolated rat hearts induced by ischemia reperfusion injury（I/RI），and to explore the role of Notch signaling pathway in myocardial ischemia reperfusion injury（I/RI）.MethodsThe hearts of SD rats were isolated，underwent Langendroff perfusion，and were divided into 4 groups：Control，I/RI，DAPT（1 μM）+I/RI，DAPT（1 μM）.Myocardial injuries in the rat hearts were produced by ischemia for 50 min and followed by 60 min reperfusion.HR，LVDP，±dp/dt max，CF and DP were recorded respectively before ischemia and 15，30，45 and 60 min after reperfusion；the myocardial infarct size（MI）was detected by TTC test；the special kits were used to detect the levels of lactic dehydrogenase（LDH）in the coronary flow（CF）.ResultsIn the I/R group，the systolic and diastolic functions significantly reduced（P＜0.01），the MI and LDH in the CF increased significantly（P＜0.01）.Compared to the I/RI group，the above parameters in DAPT+IR group were worse（P＜0.01）；compared to the Control group，the parameters in DAPT group had no significant difference（P＞0.05）.ConclusionDAPT can aggravate the myocardial I/RI，Notch signaling pathway may play a vital regulatory role in the myocardial reperfusion injury.

DAPT；Isolated rat heart；Ischemia reperfusion injury；Myocardial protection

R654.1

A

1672-1403（2013）01-0041-04

2012-04-10）

2012-05-28）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（81070198，81102687）陜西省社會(huì)發(fā)展推動(dòng)基金資助（2012JQ4001，2012SF2-21-1）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科（楊 陽(yáng)、段維勛、王 寧、梁振興、金振曉、易定華）；223100淮安，中國(guó)人民解放軍第82醫(yī)院骨科（姜 鵬）；010010呼和浩特，中國(guó)人民解放軍第253醫(yī)院口腔科（周 建）