沈云龍，謝婷婷，柳俊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070）

遺傳育種

馬鈴薯薯形突變體T-DNA插入側(cè)翼序列分析

沈云龍，謝婷婷，柳俊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070）

以‘鄂馬鈴薯3號(hào)’為材料，通過(guò)試管薯快速轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一個(gè)編號(hào)為pCL2b-2薯形突變系，本研究通過(guò)表型鑒定、側(cè)翼序列擴(kuò)增和生物信息學(xué)等方法對(duì)其進(jìn)行了研究，目的是分析該突變株表型變化控制機(jī)制。結(jié)果表明，該突變體的試管薯和溫室收獲塊莖長(zhǎng)寬比在p<0.05水平均顯著大于野生型受體薯，其中試管薯長(zhǎng)寬比為1.78，野生型試管薯長(zhǎng)寬比為1.33；溫室收獲塊莖長(zhǎng)寬比為1.50，野生型塊莖為1.29；利用hiTAIL-PCR技術(shù)對(duì)TDNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的側(cè)翼序列分析表明，T-DNA插入編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）基因內(nèi)部，該基因?yàn)榧?xì)胞分裂素合成酶基因（StIPT），暗示StIPT基因可能參與馬鈴薯薯形發(fā)育。

馬鈴薯；薯形；異戊烯基轉(zhuǎn)移酶

馬鈴薯是非谷類作物中最重要的糧食作物，不僅富含淀粉，同時(shí)還含有蛋白質(zhì)、維生素B1、B2和維生素C等，具有全面的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。馬鈴薯耐貧瘠、耐干旱，是許多國(guó)家的主食，在解決糧食問(wèn)題中具有重要作用。全球馬鈴薯年產(chǎn)量保持著穩(wěn)定的增長(zhǎng)，2011年已達(dá)到3.74億t，其中中國(guó)作為馬鈴薯的第一生產(chǎn)大國(guó)，產(chǎn)量達(dá)到8 835萬(wàn)t。

塊莖是馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)生殖和作為蔬菜糧食的重要器官，其發(fā)育直接關(guān)系到馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)以及產(chǎn)量。馬鈴薯塊莖形成包括形態(tài)學(xué)的建成和貯藏物的積累兩個(gè)過(guò)程。馬鈴薯生長(zhǎng)過(guò)程中，其地下莖節(jié)長(zhǎng)出側(cè)芽并發(fā)育為匍匐莖[1]，在合適的條件下，匍匐莖頂端細(xì)胞生長(zhǎng)方向改變，經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大過(guò)程完成塊莖的形成。馬鈴薯塊莖形成過(guò)程中積累了大量的碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，其中最顯著的是Patatin和淀粉的積累[2]。植物激素在馬鈴薯塊莖發(fā)育中起著重要作用，其中赤霉素（GAs）能促進(jìn)匍匐莖的形成，但抑制塊莖發(fā)育[3]；生長(zhǎng)素（IAA）不同濃度處理對(duì)馬鈴薯塊莖發(fā)育影響不同，其機(jī)制尚不明確[4]；細(xì)胞分裂素（CK）對(duì)馬鈴薯塊莖形成具有雙向調(diào)節(jié)作用，但其調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。在馬鈴薯中過(guò)量表達(dá)擬南芥細(xì)胞分裂素氧化酶基因AtCKX2，植株內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量降低，該轉(zhuǎn)基因株系在非誘導(dǎo)結(jié)薯?xiàng)l件下也能結(jié)薯，在誘導(dǎo)結(jié)薯?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系形成的塊莖大于對(duì)照，但單株結(jié)薯量降低[5]。

外觀品質(zhì)是馬鈴薯塊莖品質(zhì)的重要部分，其中薯形是一些加工性狀的重要品質(zhì)，如薯片加工要求圓形和橢圓形薯形，薯?xiàng)l加工要求長(zhǎng)柱形或者長(zhǎng)橢圓形薯形。目前全世界廣泛使用的炸條品種，只有加拿大在80年代初選育的‘Shepody’[6]。由于控制馬鈴薯薯形的遺傳基礎(chǔ)目前并不十分清楚，馬鈴薯薯形育種效率一直很低。

本實(shí)驗(yàn)室用pBI21載體在以E3為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，獲得一批T-DNA插入突變株系，其中編號(hào)pCL2b-2（未發(fā)表）的株系在塊莖表型上與受體E3相比顯著增長(zhǎng)，疑是長(zhǎng)薯形突變體。本研究對(duì)pCL2b-2突變體進(jìn)行了表型觀察和插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分析，以期了解薯形變異相關(guān)的分子信息，為薯形發(fā)育研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘鄂馬鈴薯3號(hào)’（E3）無(wú)菌試管苗為本實(shí)驗(yàn)室保存材料。pCL2b是具有低溫誘導(dǎo)活性的塊莖特異表達(dá)融合啟動(dòng)子，由李萌博士改造。pCL2b-2是以E3為受體，將pCL2b連接到載體pBI121，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因株系，并由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 表型鑒定

E3和pCL2b-2試管苗分別在含4%蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基，長(zhǎng)日照（16 h光照，8 h黑暗）培養(yǎng)3周后，將各植株2～4莖節(jié)轉(zhuǎn)入含8%蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基的玻璃試管中，短日照（8 h光照，16 h黑暗）誘導(dǎo)結(jié)薯。每個(gè)試管苗含一個(gè)莖節(jié)，11~18個(gè)試管苗作為一個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)。將E3與pCL2b-2試管苗在溫室種植，共3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)8~10缽，對(duì)30 g以上的塊莖用于薯形鑒定。薯形采用長(zhǎng)寬比統(tǒng)計(jì)。

1.3 RB端載體骨架整合分析

參考成善漢等[7]的方法，在載體pBI121靠近右邊界序列（RB）的T-DNA區(qū)設(shè)計(jì)右邊界反向引物RP-A1，根據(jù)右邊界側(cè)翼序列設(shè)計(jì)右邊界正向引物RP-S1和RP-S2等（圖1，各引物間距為500～1 000 bp）。用RP-A1依次與正向引物RP-S1和RP-S2等配對(duì)擴(kuò)增pCL2b-2基因組DNA中插入的T-DNA的RB端側(cè)翼序列，分析載體插入片段的大小，各引物序列見(jiàn)表1。

1.4 RB端側(cè)翼序列擴(kuò)增

根據(jù)基因組中已知的插入序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物SP1、SP2和SP3，分別和4組簡(jiǎn)并引物組合（表1），以pCL2b-2基因組DNA為模板，利用hiTAIL-PCR技術(shù)進(jìn)行連續(xù)的3輪PCR擴(kuò)增。將引物SP1和4個(gè)隨機(jī)引物分別組合進(jìn)行第1輪擴(kuò)增；將第1輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行40倍稀釋作為第2輪反應(yīng)的模板，利用SP2和通用引物AC1進(jìn)行第2輪擴(kuò)增反應(yīng)；將第2輪產(chǎn)物10倍稀釋，作為第3輪反應(yīng)模板，用引物組合SP3和AC1進(jìn)行第3輪擴(kuò)增，選擇較大的片段測(cè)序。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2，PCR反應(yīng)程序參考Liu和Chen[8]，利用不同的退火溫度選擇性地從突變體中克隆外源插入序列的側(cè)翼序列。

圖1 pBI121載體骨架整合分析引物位置Fig 1 Primers for integration analysis on vector pBI121 backbone

表1 hiTAIL-PCR及載體骨架整合分析所用的引物序列Table 1 Primers for hiTAIL-PCR and integration analysis of vector backbone

表2 hiTAIL-PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction systems used in hiTAIL-PCR

1.5 插入位點(diǎn)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，查找T-DNA插入位點(diǎn)，并分析插入位點(diǎn)序列信息。對(duì)插入位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，進(jìn)一步確定插入位點(diǎn)的詳細(xì)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織培養(yǎng)條件下的表型鑒定

將E3和pCL2b-2在含4%蔗糖的MS培養(yǎng)基中長(zhǎng)日照下培養(yǎng)3周后，分別取葉、根和全株進(jìn)行表型鑒定。結(jié)果顯示，組織培養(yǎng)條件下，長(zhǎng)日照生長(zhǎng)3周的pCL2b-2植株生長(zhǎng)正常，與其受體基因型E3在植株表型和長(zhǎng)勢(shì)上基本一致（圖2）。

圖2 pCL2b-2和E3表型觀察Figure 2 Characteration of pCL2b-2 mutant and E3

圖3 pCL2b-2和E3組織培養(yǎng)條件下表型鑒定Figure 3 Phenotype identification of pCL2b-2 mutant and E3 by culture in vitro

結(jié)薯誘導(dǎo)條件下（短日照、8%蔗糖濃度），pCL2b-2和E3均正常結(jié)薯。3次重復(fù)的試管薯長(zhǎng)寬比統(tǒng)計(jì)表明，pCL2b-2試管薯長(zhǎng)寬比為1.78，比對(duì)照E3超出33.92%，統(tǒng)計(jì)分析表明，二者差異達(dá)到顯著水平（圖3）。

2.2 溫室種植條件下的薯形鑒定

將pCL2b-2和E3同時(shí)在溫室種植。正常成熟后，取薯塊大于等于30 g的薯進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，在溫室種植條件下，pCL2b-2薯形也顯著長(zhǎng)于E3，長(zhǎng)寬比增長(zhǎng)16.88%（圖4）。組織培養(yǎng)和溫室種植條件下表型鑒定結(jié)果證明，T-DNA的插入沒(méi)有影響突變株的正常生長(zhǎng)，但薯形顯著長(zhǎng)于受體基因型E3。

圖4 pCL2b-2和E3溫室種植條件下表型鑒定Figure 4 Phenotype identification of pCL2b-2 and E3 by culture in vivo

2.3 側(cè)翼序列擴(kuò)增及插入位點(diǎn)分析

利用引物組合RP-A1和RP-S1對(duì)pCL2b-2基因組進(jìn)行擴(kuò)增（圖5A），未擴(kuò)增出條帶，表明T-DNA右邊界（RB）旁側(cè)500 bp外無(wú)載體序列插入到馬鈴薯基因組中。

在PBI121 RB和NOS-P區(qū)設(shè)計(jì)3個(gè)特異性巢式引物SP1、SP2和SP3（表1），采用hiTAIL-PCR方法擴(kuò)增RB端側(cè)翼序列。用SP1分別和隨機(jī)引物L(fēng)AD-1、LAD-2、LAD-3和LAD-4組合（表1），以pCL2b-2基因組DNA為模板進(jìn)行第1輪擴(kuò)增。將第1輪的4組擴(kuò)增產(chǎn)物40倍稀釋作為模板，利用引物組合SP2和AC1進(jìn)行第2輪擴(kuò)增（圖5B）。特異性引物與隨機(jī)引物L(fēng)AD-3擴(kuò)增出來(lái)的片段最長(zhǎng)，更易擴(kuò)增出插入片段側(cè)翼序列，將該組合第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物10倍稀釋作為模板，利用引物組合SP3和AC1進(jìn)行第3輪擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，A-T克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑選3個(gè)克隆測(cè)序獲得了965 bp的序列，其中139 bp為T(mén)-DNA上RB元件3'端末端6個(gè)堿基后的序列（圖6），進(jìn)一步證明了載體pBI121上RB元件5'端無(wú)片段整合到植物基因組中。

圖5 pCL2b-2 RB端骨架整合分析及側(cè)翼序列擴(kuò)增Figure 5 Integration analysis of vector backbone and flanking sequence amplification on pCL2b-2

圖6 RB端側(cè)翼序列擴(kuò)增Figure 6 Flanking sequence amplification of RB

將已擴(kuò)增的965 bp序列中的826 bp非TDNA序列在馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（PGSC）中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該片段與異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）基因第4個(gè)內(nèi)含子的822 bp片段同源性達(dá)到89%。結(jié)果表明在pCL2b-2基因組中，T-DNA插入位點(diǎn)是異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）基因的第4個(gè)內(nèi)含子，該基因在PGSC_DM_v3.4_gene數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為PGSC0003DMG400035440，名稱為StIPT。該基因全長(zhǎng)8 607 bp，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。

為了進(jìn)一步確定pCL2b-2的T-DNA是簡(jiǎn)單插入到StIPT基因的第4個(gè)內(nèi)含子還是替換掉了該內(nèi)含子的某一段序列，本研究在T-DNA左邊界序列（LB）前端設(shè)計(jì)了引物T-DNA LB-1a：5'-ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'，在StIPT基因T-DNA插入位點(diǎn)3'端417bp處設(shè)計(jì)引物T3-S2：5'-GCATCCATTGCTTGAACGGAGGTT-3'，用上述引物對(duì)pCL2b-2基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了606 bp序列（圖7）。

將606 bp片段分別與pBI121和StIPT基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段中103 bp為StIPT第4個(gè)內(nèi)含子部分片段，與RB端擴(kuò)增的StIPT內(nèi)含子序列相隔317 bp；剩余的503 bp為T(mén)-DNA上LB元件5'端113個(gè)堿基前的序列。載體pBI121 T-DNA全長(zhǎng)6195 bp，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，T-DNA上RB元件（25 bp）及其邊界6 bp和LB元件（26 bp）及其邊界113 bp未插入到StIPT基因中，而T-DNA上剩余片段替換了StIPT第4個(gè)內(nèi)含子的317 bp片段（圖8）。

圖7 LB端側(cè)翼序列擴(kuò)增Figure 7 Flanking sequence amplification of LB

圖8 StIPT基因T-DNA插入分析Figure 8 Analysis of T-DNA insertion into StIPT

3 討論

IPT基因最初在根癌農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)，是細(xì)胞分裂素合成的限速酶[9]。在擬南芥中已證實(shí)了編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的9個(gè)家族成員，分別為ATIPT1-ATIPT9[10]。有研究表明，在馬鈴薯中超量表達(dá)農(nóng)桿菌IPT基因獲得的三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系1、11和13，頂端優(yōu)勢(shì)降低，節(jié)間多且短，葉片變短，同時(shí)根變少[11]。轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞分裂素含量增加，其中一個(gè)編號(hào)11的株系細(xì)胞分裂素含量增加了40%。一些株系在非誘導(dǎo)條件下可發(fā)生匍匐莖，在誘導(dǎo)條件下提前結(jié)薯[12]。但到目前為止，尚沒(méi)有突變馬鈴薯自身IPT基因的相關(guān)報(bào)道。本研究首次報(bào)道插入突變馬鈴薯StIPT基因后，植株薯形發(fā)生改變，證實(shí)StIPT基因在馬鈴薯植株形態(tài)建成中可能發(fā)揮重要作用。但該基因突變后，與野生型植株相比，馬鈴薯突變體并未表現(xiàn)出其他形態(tài)變化。我們推測(cè)，其可能原因是StIPT基因僅在塊莖發(fā)育過(guò)程中特異表達(dá)或該位點(diǎn)突變對(duì)StIPT基因表達(dá)水平的影響較小。

最近研究顯示，在馬鈴薯中過(guò)量表達(dá)擬南芥細(xì)胞分裂素氧化酶基因AtCKX2，植株內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量降低，影響結(jié)薯[5]。本研究通過(guò)分析StIPT基因突變體植株表型，推測(cè)StIPT基因突變后，植株體內(nèi)細(xì)胞分裂合成受到影響。突變體內(nèi)源細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比例發(fā)生變化，使得馬鈴薯塊莖發(fā)育過(guò)程中，薯形由圓形發(fā)育為長(zhǎng)橢圓形。

內(nèi)含子是基因在轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中剪切掉的非編碼序列，同時(shí)也參與基因的表達(dá)調(diào)控。內(nèi)含子5'和3'末端的剪切位點(diǎn)高度保守，其剪切的準(zhǔn)確性決定了基因能否正常表達(dá)。除去剪切位點(diǎn)，內(nèi)含子并非無(wú)意義的堿基序列。豬肌球蛋白基因MyHC第2個(gè)內(nèi)含子中含有1個(gè)75 bp的正調(diào)控元件，能通過(guò)調(diào)控MyHC的轉(zhuǎn)錄起始來(lái)增強(qiáng)該基因的表達(dá)；而與該元件偶聯(lián)的顯性負(fù)調(diào)控元件長(zhǎng)81 bp，能下調(diào)該基因的表達(dá)[13]。內(nèi)含子中能增強(qiáng)基因表達(dá)的元件與增強(qiáng)子不同，它對(duì)序列的順序和元件所處的位置有很強(qiáng)的依賴性[14]。Salgueiro等[15]發(fā)現(xiàn)玉米泛素基因第1個(gè)內(nèi)含子含有類似啟動(dòng)子的序列，能發(fā)揮啟動(dòng)子的功能。ESRα是豬雌激素受體α基因，其第1個(gè)內(nèi)含子的突變會(huì)影響豬的脂肪沉積量和產(chǎn)仔量[16,17]。與此相似，本研究中StIPT基因第4個(gè)內(nèi)含子的317 bp片段可能含有調(diào)控該基因表達(dá)的功能元件，T-DNA的替換使得StIPT損失了該調(diào)控元件，從而改變了StIPT基因的表達(dá)水平。

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Flanking Sequence Analysis of a Potato T-DNA Inserted Mutant of Tuber Shape

SHEN Yunlong,XIE Tingting,LIU Jun＊
(College of Life Science and Technology/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology(HAU),Ministry of Education/National Center for Vegetable Improvement(Central China),Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)

A tuber shape mutant,pCL2b-2,was obtained by T-DNA inserted transformation on microtuber of potato (Solanum tuberosum L.)variety'E-potato 3'(E3).In this study,we identified the tuber shape,amplified the T-DNA flanking sequences and did some bioinformatics work to analyze the tuber shape control mechanism.The length-width ratio of in vitro grown microtubers of the mutant(1.78)was significantly greater than that of the wild type(1.33)(p＜0.05).The shape of tubers grown in pots was also significantly different between pCL2b-2 mutant and the wild type,1.50 vs.1.29.Flanking sequences of inserted location of the T-DNA were amplified by hiTAIL-PCR.Bioinformatics analysis showed thatthe T-DNA was inserted into the isopentenyltransferase(IPT)gene which encodes a cytokinins synthetase StIPT.Itis proposed that StIPT may participate in morphogenesis ofpotato tubers.

potato;tuber shape;isopentenyltransferase(IPT)

S532

A

1672－3635（2013）03-0129-07

2013-04-29

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系體系項(xiàng)目（CARS-10-P08）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000736）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師基金課題（20100146120038）。

沈云龍（1988-），男，研究生，研究方向?yàn)轳R鈴薯生物技術(shù)育種。

柳俊，教授，研究方向?yàn)轳R鈴薯生物技術(shù)育種，E-mail:liujun@mail.hzau.edu.cn。