白曉潔，　封啟龍，　吳博威

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，山西 太原 030001)

鈉鈣交換體(sodium-calcium exchanger, NCX)是心肌細(xì)胞膜上重要的雙向離子轉(zhuǎn)運體，介導(dǎo)3Na+和1Ca2+的跨膜流動。在前期研究中，我們針對NCX分子結(jié)構(gòu)中α-1重復(fù)序列124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145合成肽段，制備出相應(yīng)的多克隆抗體，并且發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體可劑量依賴性地增強(qiáng)正常大鼠心室肌細(xì)胞NCX電流，同時也可以一定程度地增強(qiáng)L型Ca2+電流和Na+-K+泵電流[1]。從理論上分析，同時激動NCX、Na+-K+泵和L型Ca2+通道，可以有效改善心臟的收縮、舒張功能。本實驗利用離體大鼠心臟灌流和血管環(huán)張力測定的方法，觀察該多克隆抗體對離體大鼠心臟和血管緊張活動的影響，并與傳統(tǒng)強(qiáng)心藥哇巴因(ouabain)和L型Ca2+通道激動劑(±)Bay K8644的作用進(jìn)行比較，以分析該抗體對心臟和血管作用的特點及其可能的機(jī)制。

材　料　和　方　法

1動物

清潔級Wistar大鼠，雌雄不拘，體重250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(晉)2009-0001。

2主要試劑和溶液成分

2.1抗NCX特異位點抗體[1]按照NCX分子結(jié)構(gòu)中α-1重復(fù)序列124HNFTAGDLGPSTIVGSAAFNMF145合成肽段，主動免疫大鼠，制備并提純相應(yīng)的多克隆抗體，陰性IgG的制備除免疫動物時未加合成肽段外，其余與上述抗體制備過程相同。

2.2哇巴因、(±)Bay K8644和HEPES均購自Sigma。其余為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2.3臺氏液成分(mmol/L)：NaCl 140, KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0， 葡萄糖 10.0，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH調(diào)pH值至7.4。

2.4KH液成分(mmol/L)NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，葡萄糖 11.1，HEPES 5.0，用NaOH調(diào)pH值至7.4。

3主要儀器設(shè)備

Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)(AD Instruments);RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠);YZ1515蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司);PowerLab/4S血管環(huán)實驗系統(tǒng)(AD Instruments)。

4主要方法

4.1Langendorff心臟灌流裝置觀察離體大鼠心臟心功能和冠脈阻力的變化將大鼠快速擊昏后取出心臟，經(jīng)主動脈懸掛在Langendorff裝置上，給予飽和氧的臺氏液灌注(恒流灌注，灌流速度為9 mL/min)。用眼科剪剪掉左心耳，將一橡膠球囊經(jīng)二尖瓣插入左心室，橡膠球囊內(nèi)充以生理鹽水，與橡膠球囊相連的塑料管另一側(cè)與一壓力換能器相連。在主動脈灌流管處以三通管連接一壓力換能器，用以監(jiān)測冠脈阻力。為了排除心率對心功能的影響，外加刺激器控制心臟起搏頻率為200 beats/min，刺激強(qiáng)度為閾刺激強(qiáng)度的2倍。臺氏液灌流穩(wěn)定30 min后，給予相應(yīng)藥物，觀察大鼠離體心臟血流動力學(xué)指標(biāo)[左室發(fā)展壓、左心室內(nèi)壓上升最大速率(maximal rate of rise of left ventricular pressure，+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓下降最大速率(maximal rate of decline of left ventricular pressure，-dp/dtmax)]的變化，同時記錄冠脈阻力的變化和心律失常發(fā)生率。

4.2離體大鼠胸主動脈環(huán)實驗觀察血管張力的變化擊昏成年大鼠，快速開胸，取出胸主動脈，置于冰冷KH液中，除凈血管外脂肪和結(jié)締組織，剪成5 mm寬的主動脈環(huán)。系統(tǒng)調(diào)零，將血管環(huán)固定懸掛于張力測定裝置上，浸入含95% O2和5% CO2的KH液的浴槽中，37 ℃平衡2 h。在平衡期間，每隔20 min換液1次，調(diào)整負(fù)荷為1 g。穩(wěn)定后，給予相應(yīng)藥物，觀察對大鼠離體胸主動脈環(huán)張力的影響。

5統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行多組間單因素方差分析(ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1抗NCX特異位點抗體對離體大鼠灌流心臟心功能的影響

10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L 抗NCX特異位點抗體劑量依賴性地使大鼠離體心臟心功能(左室發(fā)展壓、+dp/dtmax和-dp/dtmax)增強(qiáng)，見表1，特別是-dp/dtmax值顯著增加，表明心臟舒張功能明顯加強(qiáng)。在整個給藥過程中沒有心律失常發(fā)生。

表1　抗體對離體灌流大鼠心臟心功能的影響

**P<0.01vsnegative IgG group.

哇巴因(0.5 mmol/L)和(±)Bay K8644(0.1 mmol/L)對離體灌流大鼠心臟左室發(fā)展壓及+dp/dtmax也有增強(qiáng)作用，作用強(qiáng)度與40 nmol/L抗體的作用相當(dāng)，見圖1、2。但(±)Bay K8644(0.1 mmol/L)對-dp/dtmax無明顯影響，哇巴因有使-dp/dtmax下降的趨勢，但無顯著差異，見圖2。在給藥過程中，哇巴因(0.5 mmol/L)作用5 min后，多數(shù)離體心臟出現(xiàn)了≥5 beats/min的早搏(5只實驗大鼠中有4只出現(xiàn))，同時心臟出現(xiàn)不規(guī)則收縮。灌流(±)Bay K8644(0.1 mmol/L)過程中離體大鼠心臟沒有出現(xiàn)心律失常。

Figure 1. The effects of the site-specific antibody of NCX (40 nmol/L), ouabain (0.5 mmol/L) and (±)Bay K8644 (0.1 mmol/L) on left ventricular developed pressure of the isolated rat hearts.Mean±SD. Control:n=10; negative IgG:n=5; antibody:n=5; ouabain:n=5; (±)Bay K8644:n=5.*P<0.05vscontrol.

圖1抗鈉鈣交換體特異位點抗體與哇巴因、(±)BayK8644對離體大鼠心臟左室發(fā)展壓作用的比較

2抗NCX特異位點抗體對離體大鼠灌流心臟冠脈阻力的影響

10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L抗體對大鼠離體灌流心臟冠脈阻力沒有明顯影響。而 哇巴因(0.5 mmol/L)和(±)Bay K8644(0.1 mmol/L)能夠顯著增加大鼠離體灌流心臟的冠脈阻力，見圖3。

Figure 2. The effects of the site-specific antibody of NCX (40 nmol/L), ouabain (0.5 mmol/L) and (±) Bay K8644 (0.1 mmol/L) on ±dp/dtmaxof the isolated rat hearts.Mean±SD.Control:n=10; negative IgG:n=5; antibody:n=5; ouabain:n=5; (±)Bay K8644:n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsouabain group;△P<0.05vs(±) Bay K8644 group.

圖2抗鈉鈣交換體特異位點抗體與哇巴因、(±)BayK8644對離體大鼠心臟±dp/dtmax作用的比較

3抗NCX特異位點抗體對離體大鼠胸主動脈環(huán)張力的影響

10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L 抗體對離體大鼠胸主動脈環(huán)張力沒有明顯影響。而哇巴因(0.5 mmol/L)和(±)Bay K8644(0.1 mmol/L)均能顯著增加離體大鼠胸主動脈環(huán)的張力，見圖4、5。

討　　論

本實驗中，我們觀察了前期篩選出的能同時激動NCX、L型Ca2+通道以及Na+-K+泵電流的多克隆NCX特異位點抗體對離體大鼠心臟和血管活動的影響。結(jié)果表明，該抗體可以不同程度地增強(qiáng)離體灌流大鼠心臟的收縮和舒張活動，并且不增加離體灌流心臟心律失常的發(fā)生率，對灌流心臟冠脈阻力以及離體大鼠胸主動脈環(huán)張力均沒有明顯影響。

Figure 3. The effects of the site-specific antibody of NCX (40 nmol/L), ouabain(0.5 mmol/L) and (±) Bay K8644 (0.1 mmol/L) on coronary resistance of isolated rat hearts.Mean±SD.Control:n=10; negative IgG:n=5; antibody:n=5; ouabain:n=5; (±)Bay K8644:n=5.*P<0.05vscontrol.

圖3抗NCX特異位點抗體與哇巴因、(±)BayK8644對離體灌流大鼠冠脈阻力作用的比較

作為鈣轉(zhuǎn)運蛋白，L型Ca2+通道和NCX在心肌細(xì)胞的興奮-收縮偶聯(lián)過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的重要作用。研究表明，在生理情況下，L型Ca2+電流是觸發(fā)肌漿網(wǎng)Ca2+釋放，進(jìn)而引起胞漿Ca2+升高的主要途徑[2]；NCX的功能則與其轉(zhuǎn)運模式有關(guān)：生理狀態(tài)下，NCX主要以正向模式參與鈣瞬變衰減過程中Ca2+外排，誘發(fā)心肌細(xì)胞舒張，反向NCX交換雖然也參與觸發(fā)肌漿網(wǎng)Ca2+釋放的過程，但不是主要觸發(fā)因素[3]。一般認(rèn)為，正向NCX外排Ca2+產(chǎn)生的內(nèi)向電流可能會誘發(fā)心肌細(xì)胞后除極和觸發(fā)活動[4]，因而是潛在的致心律失常因素。Na+-K+泵在細(xì)胞中的主要功能是建立并維持細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+的正常分布，因此其活動可以影響Na+/Ca2+交換的作用模式，并為之提供轉(zhuǎn)運動力[5]。同時，Na+-K+泵活動產(chǎn)生的外向電流可能會對抗正向NCX產(chǎn)生的內(nèi)向電流，因而在一定程度上消除NCX活動增強(qiáng)的致心律失常作用。

根據(jù)上述分析，我們推測前期篩選出的抗NCX特異位點抗體可能會同時增強(qiáng)心肌的收縮和舒張功能，且不至于誘發(fā)心律失常，這個推測在實驗結(jié)果中得到了證實。我們將該抗體的作用與傳統(tǒng)強(qiáng)心藥哇巴因和選擇性L型Ca2+通道激動劑(±)Bay K8644進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在增加心臟左室發(fā)展壓及+dp/dtmax至相同水平的情況下，該抗體可以顯著增加心臟-dp/dtmax，而哇巴因和(±)Bay K8644卻不具有此種效應(yīng)，這可能與該抗體激動NCX有關(guān)。哇巴因甚至有降低-dp/dtmax的趨勢，可能的機(jī)制是其抑制Na+-K+泵進(jìn)而減小了正向NCX的驅(qū)動力，降低了舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度下降的速率[6]；(±)Bay K8644選擇性激動L型Ca2+通道，因而增強(qiáng)了心肌收縮活動，但對舒張功能沒有影響。

Figure 4. The effects of the site-specific antibody of NCX at concentrations of 10 nmol/L,20 nmol/L and 40 nmol/L on vascular tone of isolated thoracic aorta rings.Mean±SD. Control:n=10; negative IgG:n=5; antibody (10, 20 or 40 nmol/L):n=5.

圖4抗鈉鈣交換體特異位點抗體對離體大鼠胸主動脈環(huán)血管張力的影響

除了觀察該抗NCX特異位點抗體對離體大鼠心功能的影響，我們還觀察了其對離體灌流心臟冠脈阻力和胸主動脈環(huán)張力的作用。結(jié)果顯示，該抗體對兩者沒有顯著的影響。這種效應(yīng)對臨床治療具有積極的意義，因為目前很多強(qiáng)心藥物在增強(qiáng)心肌收縮力的同時會導(dǎo)致冠脈和外周血管收縮(如兒茶酚胺類、強(qiáng)心苷類等)，引起心臟血供不足及收縮后負(fù)荷增加。該抗體血管效應(yīng)的機(jī)制還需進(jìn)一步探討，推測可能與心臟和血管的離子通道和轉(zhuǎn)運體的分布及作用比例不同有關(guān)，也可能因為血管除了平滑肌細(xì)胞外，內(nèi)皮細(xì)胞也參與其張力變化，因此作用機(jī)制更為復(fù)雜[7]。

本實驗室前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)2種Ⅲ類抗心律失常藥物E4031和dofetilide均可以增強(qiáng)正常大鼠的心泵功能，并且這種效應(yīng)可以被NCX特異性抑制劑KB-R7943 大部分阻斷，提示它們的正性肌力作用可能同激動NCX有關(guān)[8-9]。而我們篩選出的該抗NCX特異位點抗體不僅能夠激動NCX，同時可以一定程度增強(qiáng)L型Ca2+電流和Na+-K+泵電流，這種多靶點效應(yīng)組合較單純激動NCX而言，對于心泵功能(收縮和舒張)的增強(qiáng)具有更顯著的作用，而且可以部分消除激動NCX 產(chǎn)生內(nèi)向電流導(dǎo)致心律失常的風(fēng)險。

Figure 5. The effects of the site-specific antibody of NCX (40 nmol/L), ouabain (0.5 mmol/L) and (±)Bay K8644 (0.1 mmol/L)on vascular tone of the isolated thoracic aorta rings.Mean±SD. Control:n=10; negative IgG:n=5; antibody:n=5; ouabain:n=5; (±)Bay K8644:n=5.*P<0.05vscontrol.

圖5抗鈉鈣交換體特異位點抗體與哇巴因、(±)BayK8644對離體大鼠胸主動脈環(huán)張力作用的比較

為了進(jìn)一步驗證該抗體的作用機(jī)制，我們分離了大鼠心室肌細(xì)胞，分別使用NCX 抑制劑KB-R7943和L型Ca2+通道抑制劑尼卡地平預(yù)處理后，觀察該抗體對單個心室肌細(xì)胞鈣瞬變的峰值、細(xì)胞縮短程度以及Ca2+達(dá)峰值時程(time to peak，TP)、舒張期Ca2+減少50%時程(time to 50% restore，TR50)和舒張期Ca2+減少90%時程(time to 90% restore，TR90)的影響，結(jié)果表明，該特異性抗體對大鼠心肌收縮和舒張活動的影響主要是通過激動NCX和L型Ca2+通道來實現(xiàn)的, 而激動Na+-K+泵對于收縮舒張活動沒有直接的影響(結(jié)果待發(fā)表)。

Pogwizd等[10]發(fā)現(xiàn)，心力衰竭時，心肌離子通道發(fā)生重塑，在肌漿網(wǎng)Ca2+泵表達(dá)和功能下降時，NCX水平代償性增強(qiáng)，但是NCX表達(dá)或功能上調(diào)在增強(qiáng)心肌變力性的同時，其交換過程中產(chǎn)生的內(nèi)向電流存在誘發(fā)心律失常的風(fēng)險。本實驗中，我們制備得到的抗NCX特異位點抗體具有同時激動NCX、L型Ca2+通道和Na+-K+泵的作用，這種多靶點效應(yīng)從理論上分析可以促進(jìn)心肌收縮力的增強(qiáng)，同時加強(qiáng)心肌舒張功能，促進(jìn)血液回流，也具有較小的誘發(fā)心律失常和增加血管阻力的風(fēng)險。這種效應(yīng)在正常大鼠離體心臟和血管環(huán)張力實驗中得到印證，在心衰模型中是否具有理想的結(jié)果有待于進(jìn)一步證實。

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