陳攀科， 石 蓓， 龍仙萍， 劉志江， 王正龍， 王冬梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州遵義563003)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary interention，PCI)術(shù)后再狹窄仍是當(dāng)今臨床急待解決的重要問題之一［1］，再狹窄的發(fā)生主要與內(nèi)皮損傷和血管平滑肌細(xì)胞增殖等所致的新生內(nèi)膜增生及血管重塑有關(guān)。本研究小組前期研究顯示:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植能在一定程度上促進(jìn)損傷動(dòng)脈內(nèi)皮的修復(fù)，從而減輕術(shù)后血管內(nèi)狹窄的程度，但其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的作用相對(duì)較弱［2-3］。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)具有抑制VSMCs增殖的作用，對(duì)MSCs的增殖、遷移具有正向調(diào)節(jié)作用［4］。因此，本研究旨在研討CGRP修飾的大鼠MSCs在體外對(duì)大鼠VSMCs的作用及其機(jī)制，為體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，并為血管狹窄提供新的治療思路。

材料和方法

1 材料

雄性SD大鼠購(gòu)自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。慢病毒載體Lv-EGFP和Lv-CGRP由上海英為信公司提供;CGRP引物由上海英為信公司合成。所用的抗體均購(gòu)自Abcam。ELISA試劑盒購(gòu)自Biosciences。MTT購(gòu)自Promega。細(xì)胞共培養(yǎng)板購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司。

2 方法

2．1 MSCs的培養(yǎng)和鑒定 SD大鼠(100 g左右)脫臼處死后，無(wú)菌條件下獲取骨髓，離心純化并獲取MSCs。MSCs在10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3 d換液，棄懸浮細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿瓶底約90%后傳代，第2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn);取第3代細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs表面標(biāo)記物(CD29、CD45和CD90)來(lái)鑒定，分別加入各自IgG作為對(duì)照。

2．2 VSMCs的培養(yǎng)和鑒定 SD大鼠(150 g左右)頸椎脫臼處死后，無(wú)菌條件下分離全段主動(dòng)脈，去除內(nèi)外膜，將其剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，均勻擺置于培養(yǎng)瓶底。組織塊在10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4～5 d首次換液并去除組織塊，細(xì)胞鋪滿瓶底傳代，第3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn);取第5代細(xì)胞爬片后，F(xiàn)ITC標(biāo)記VSMCs所特有的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、DAPI標(biāo)記細(xì)胞核后通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行鑒定。

2．3 MSCs基因修飾和轉(zhuǎn)染 CGRP重組慢病毒轉(zhuǎn)染的 MSCs設(shè)為 MSCs-CGRP，空載病毒轉(zhuǎn)染設(shè)為MSCs-EGFP。通過熒光顯微鏡評(píng)估轉(zhuǎn)染效率和最佳感染復(fù)數(shù)。

2．4 Real-time PCR檢測(cè) 檢測(cè) MSCs中 CGRP的mRNA表達(dá)水平。CGRP重組慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs 48 h后收集細(xì)胞。按RNA抽提試劑盒操作說明，提取每一克隆的總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄酶行逆轉(zhuǎn)錄和按SYBR Green混合試劑盒說明書進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。CGRP用特殊的低聚核苷酸引物，并大鼠18S rRNA作為內(nèi)參照。引物序列 CGRP:5'-AGCCCCAGATCTAAGCGGTGTG-3'和 5'-TCCTTGGCCATATCCCTTTTCTTG-3';18S:5'-AAACGGCTACCACATCCAAG-3'和 5'-CCTCCAATGGATCCTCGTTA-3'。數(shù)據(jù)通過 Ct比較法進(jìn)行分析、定量(2－ΔΔCt)。

2．5 ELISA檢測(cè)CGRP水平 通過ELISA試劑盒檢測(cè)被轉(zhuǎn)染MSCs上清中CGRP水平。取第3代MSCs按5×105cells/well的密度接種于6孔板中，CGRP重組慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs 48 h后，棄培養(yǎng)基、PBS沖洗3次，重新加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集上清，然后根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)CGRP的濃度。

2．6 VSMCs增殖能力的檢測(cè) 將慢病毒載體介導(dǎo)CGRP轉(zhuǎn)染的MSCs與VSMCs進(jìn)行共培養(yǎng)后，通過MTT法和臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)檢測(cè)對(duì)VSMCs增殖和存活率的影響。慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs(MOI=300)后按1×105cells/well接種于 Transwell 6孔板上室中;取VSMCs按0．5～1×105cells接種于 Transwell 6孔板下室中，含0．1%FBS的DMEM培養(yǎng)同步化24 h;上、下室間為0．4μm的聚酯透明濾膜，上清由此可自由通過而細(xì)胞不能通過，CGRP修飾的MSCs分泌的CGRP與VSMCs共培養(yǎng)4 d，以單純MSCs及空載病毒轉(zhuǎn)染組為對(duì)照(MOI=300)，每天各取1組按試劑說明書方法測(cè)吸光度(A)和存活率。

2．7 VSMCs遷移能力的檢測(cè) 通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VSMCs的遷移情況。VSMCs按(0．5～1)×105cells/well接種于Transwell 6孔板下室，培養(yǎng)過夜，劃痕、PBS洗去脫落細(xì)胞;同時(shí)，將上述慢病毒轉(zhuǎn)染的MSCs按1×105cells/well接種于Transwell 6孔板上室中，進(jìn)行共培養(yǎng)3 d，每天觀察其細(xì)胞遷移情況并拍照，采用圖像分析軟件通過測(cè)量48 h和24 h遷移距離之比來(lái)計(jì)算其遷移率。

2．8 蛋白印跡法(Western blotting) 通過Western blotting檢測(cè)α-SMA和骨橋蛋白(osteoponin，OPN)的表達(dá)水平。收集上述共培養(yǎng)48 h VSMCs，提取蛋白并測(cè)定濃度(按BCA蛋白定量試劑說明書操作)，配膠，制作電泳樣品(所提蛋白與上樣緩沖液1∶1混勻并煮沸5 min)，上樣，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別按抗體說明書稀釋后加入α-SMA和OPNⅠ抗，4℃孵育過夜，加入熒光標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育，PBS-T洗后，用奧德賽專用機(jī)器測(cè)灰度值，分別以標(biāo)準(zhǔn)濃度的β-actin作對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MSCs的形態(tài)及表型特征

原代細(xì)胞24～48 h換液后可見少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，第7～8 d細(xì)胞鋪滿瓶底90%左右，形態(tài)呈長(zhǎng)梭型，漩渦狀排列，傳代至第5代，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變(圖1A);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代MSCs表型特征，結(jié)果顯示 CD29達(dá)97．76%，CD90達(dá)98．53%，而CD45為12．34%，符合MSCs生物學(xué)特征(圖1B)。

Figure 1．Morphological and phenotypic characterization of MSCs．A:the morphological change of MSCs．Passage cells were mostly spindle and uniformly distributed(×100)．B:the3rd-passage MSCs detected by FCM highly expressed the surface marker molecules CD29(97．76%)and CD90(98．53%)，and lowly expressed CD45(12．34%)．圖1 MSCs形態(tài)及表型特征

2 VSMCs的形態(tài)學(xué)及鑒定

原代培養(yǎng)至第4天，可見有細(xì)胞從組織塊邊緣游出，細(xì)胞形態(tài)可呈梭形、多角或不規(guī)則形，第10 d左右可鋪滿，呈現(xiàn)VSMCs典型“峰－谷”樣生長(zhǎng)，傳代至第6代細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，未見明顯改變(圖2A)。

VSMCs的免疫熒光鑒定:激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片，大部分細(xì)胞可見平滑肌細(xì)胞所特有，胞漿中大量綠色平行絲狀α-SMA陽(yáng)性染色，沿細(xì)胞縱軸分布的肌絲結(jié)構(gòu)清晰(圖2B)。

3 CGRP基因轉(zhuǎn)染效率和CGRP修飾的MSCs中CGRP的表達(dá)

慢病毒LV-CGRP(MOI=30)轉(zhuǎn)染 MSCs后，轉(zhuǎn)染效率達(dá)85%以上(圖3A)。Real-time PCR檢測(cè)CGRP修飾MSCs后CGRP的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果分別為:與MSCs組和MSCs-EGFP組相比較，MSCs-CGRP組的表達(dá)明顯增加，約為前2組的9．85倍(圖3B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。ELISA檢測(cè)它們的蛋白分泌情況，結(jié)果顯示，MSCs組和MSCs-EGFP組培養(yǎng)48 h后的上清中幾乎無(wú)CGRP表達(dá)，而MSCs-CGRP組培養(yǎng)48 h后的上清中有CGRP表達(dá)，濃度為25．30 ng/L(圖3C)，明顯多于前2組(P＜0.01)。

Figure 2．Morphological characterization and immunofluorescence verification of VSMCs(×100)．A:the morphological change of VSMCs．Passage cells showed“valley peak”appearance under inverted microscope．B:expression ofα-SMA in the cytoplasm of VSMCs showed green with immunofluorescence staining．圖2 VSMCs的形態(tài)及免疫熒光鑒定

4 CGRP修飾的MSCs在體外對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

通過 MTT法檢測(cè) MSCs組、MSCs-EGFP組和MSCs-CGRP組中VSMCs的A值，連續(xù)觀察4 d，在各個(gè)時(shí)點(diǎn)，與 MSCs組和 MSCs-EGFP組相比，MSCs-CGRP組中VSMCs的增殖能力降低(P＜0．05);同時(shí)，每組細(xì)胞的細(xì)胞存活率通過臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)均大于85%，由此可知，慢病毒介導(dǎo)的CGRP基因轉(zhuǎn)染MSCs后對(duì)VSMCs的增殖有抑制作用，見圖4。

5 CGRP修飾的MSCs在體外對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察共培養(yǎng)48 h與24 h之間VSMCs的劃痕修復(fù)距離之比來(lái)判斷其遷移能力，結(jié)果如圖 5所示，與 MSCs組(51．60±0．80)% 和MSCs-EGFP組(49．56 ±0．93)% 相比，MSCs-CGRP組(21.80±0．65)%中VSMCs遷移明顯降低(P＜0.05)，見圖5。

6 CGRP修飾的MSCs在體外對(duì)VSMCs表型改變的影響

Western blotting檢測(cè)各組的α-SMA(收縮表型)和OPN(合成分泌表型)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與MSCs組和MSCs-EGFP組相比，MSCs-CGRP組中α-SMA表達(dá)增加，OPN表達(dá)減少(均 P＜0．05)，見圖6。

Figure 3．Transfection efficiency of CGRP gene and its expression in MSCs．A:after infection with CGRP recombinant lentiviral vector(MOI=30)，MSCs over-expressed EGFP，and the infection rate was more than 85．0%(×100);B，C:compared with MSCs group and MSCs-EGFP group，the mRNA(B)and protein(C)expression of CGRPin CGRP-modified MSCs was obviously increased．Mean ± SD．n=3．＊＊P ＜0．01 vs other groups．圖3 CGRP基因轉(zhuǎn)染效率和CGRP修飾的MSCs中CGRP的表達(dá)

Figure 4．The proliferation of VSMCs detected by MTT assay．Mean ±SD．n=6．*P ＜0．05 vs other groups．圖4 MTT法檢測(cè)CGRP修飾的MSCs對(duì)VSMCs增殖的影響

Figure 5．The migratory ability of VSMCs detected by scarification assay．圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CGRP修飾MSCs對(duì)VSMCs遷移的影響

Figure 6．The expression ofα-SMA and OPN in VSMCs after coculture for 48 h was evaluated by Western blotting．Mean ±SD．n=3．*P ＜0．05 vs other groups．圖6 Western blotting檢測(cè)共培養(yǎng)后48 h VSMCs的α-SMA和OPN的表達(dá)

討 論

血管損傷后的異常內(nèi)膜增生在血管閉塞性疾病的發(fā)展過程中起著重要作用，比如動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄(restenosis，RS)，其中血管平滑肌細(xì)胞增殖在上述發(fā)病機(jī)理中起重要作用。目前研究表明，VSMCs異常增殖、遷移、合成并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是導(dǎo)致 RS的主要原因［5］，此病理過程中VSMCs表型轉(zhuǎn)化又是血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的起始步驟［6］。VSMCs具有2種表型，分別是收縮型(分化型)和合成型(去分化型)，兩者之間具有可變性。在正常成熟血管壁中，VSMCs以前者為主，又稱紡錘樣細(xì)胞，呈典型“峰－谷”樣生長(zhǎng)，表達(dá)一系列特異性收縮蛋白，如α-SMA等來(lái)維持其收縮功能。當(dāng)血管內(nèi)皮受損(如動(dòng)脈粥樣硬化、球囊損傷等)或?qū)SMCs進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，VSMCs增殖并發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，其分化型標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)甚至消失，而合成型標(biāo)志基因重新開放，收縮功能消失，這種狀態(tài)的VSMCs稱為合成型VSMCs，它能合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)并獲得遷移和增殖能力，其特異性蛋白為OPN［7-8］。

CGRP是體內(nèi)廣泛存在的一種的血管活性肽，參與各種生理、病理過程，包括抑制炎癥、細(xì)胞增殖、血管活性物質(zhì)(血管緊張素Ⅱ)等，是目前最強(qiáng)的內(nèi)源性擴(kuò)血管肽之一。CGRP具有抑制VSMCs增殖及表型轉(zhuǎn)化(從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化)的作用，其作用可能通過抑制周期蛋白D、E，使VSMCs停留于G0/G1期，通過限制細(xì)胞周期進(jìn)程而達(dá)到抑制VSMCs增殖的作用。多項(xiàng)研究也顯示，CGRP能顯著抑制血管緊張素Ⅱ及胎牛血清誘導(dǎo)的VSMCs增殖及表型轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展、減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，抑制胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶和蛋白磷酸化及蛋白激酶C的活性等有關(guān)［9-10］。還有研究顯示，CGRP可能通過抑制血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和核因子κB信號(hào)通路的激活，從而抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。以上研究資料顯示，CGRP對(duì)VSMCs增殖及表型改變等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的干預(yù)作用［11］。

近年來(lái)，MSCs在心血管疾病中的應(yīng)用是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)［12-13］。MSCs具有不斷自我更新、多向分化潛能、免疫耐受性以及易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)而其多能性不受影響等特點(diǎn)［14］，并且可能成為心血管損傷后修復(fù)的理想細(xì)胞［15］。本研究小組前期研究顯示:MSCs移植能在一定程度上促進(jìn)損傷動(dòng)脈內(nèi)皮的修復(fù)，從而減輕術(shù)后血管內(nèi)狹窄的程度，但其對(duì)VSMCs的作用相對(duì)較弱。

本實(shí)驗(yàn)首先通過real-time PCR和ELISA證實(shí)慢病毒載體介導(dǎo)的CGRP成功轉(zhuǎn)染MSCs，轉(zhuǎn)染的MSCs中高表達(dá)CGRP且能分泌CGRP蛋白，與MSCs組和MSCs-EGFP組相比有顯著差異(P＜0．01);然后通過將CGRP修飾的MSCs與VSMCs進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn):與MSCs-CGRP共培養(yǎng)的VSMCs增殖和遷移能力明顯下降，與MSCs組和MSCs-EGFP組相比有顯著差異(P＜0．05)，而后2組間比較無(wú)顯著差異(P＞0．05)，說明CGRP修飾的MSCs對(duì)VSMCs的增殖和遷移有抑制作用。Deng等［16］研究也發(fā)現(xiàn)，體外腺病毒載體介導(dǎo)CGRP基因轉(zhuǎn)染MSCs后分泌的CGRP蛋白具有抑制VSMCs增殖的效應(yīng)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)通過Western blotting檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞的表型標(biāo)志還發(fā)現(xiàn)，MSCs-CGRP組的α-SMA較其余2組增加，而OPN較其余2組減少(P＜0．05)，其余2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，表明CGRP轉(zhuǎn)染的MSCs在體外可使VSMCs由合成分泌型向收縮表型轉(zhuǎn)換，有助于減少VSMCs的分泌和合成，從而抑制VSMCs的增殖。

綜上所述，CGRP修飾的MSCs能分泌CGRP蛋白，分泌的CGRP在體外可能通過抑制VSMCs的表型改變(分化型向去分化型轉(zhuǎn)化)，從而抑制VSMCs的增殖和遷移，為體內(nèi)基因治療以VSMCs增殖為主要病理改變的血管閉塞性疾病奠定了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。