王　琛,　劉　蜜,　王曉礽,　宋丹丹,　劉秀華△,　史大卓△

(解放軍總醫(yī)院 1中醫(yī)科, 3病理生理研究室, 北京 100853； 2中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京100091)

西洋參莖葉總皂苷(Panaxquinquefoliumsaponins, PQS) 是西洋參莖葉中主要的活性成分。以往實(shí)驗(yàn)研究表明，PQS具有減輕缺血/再灌注(ische-mia/reperfusion, I/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、心律失常和改善梗死后心室重構(gòu)等作用[1-3]，其機(jī)制可能與增強(qiáng)抗氧化酶活性、維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等有關(guān)[4]。

研究表明鈣超載是I/R發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)是唯一依賴于Ca2+及鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)調(diào)控的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[5]。PQS又具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的作用[4]。我們研究證實(shí)PQS可以減輕離體培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[6-7]。那么，PQS減輕心肌細(xì)胞H/R損傷的機(jī)制是否與CaN有關(guān)尚缺少研究，本部分工作利用乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧 (hypoxia/reoxygenation, H/R) 模型通過轉(zhuǎn)染pCDB-CaN質(zhì)?；駽aN特異性抑制劑FK506干擾CaN表達(dá)，以探討PQS減輕心肌細(xì)胞H/R損傷的機(jī)制。

材　料　和　方　法

1動物與試劑

清潔級24 h內(nèi)新生SD乳鼠，購自北京市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；PQS粉劑由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供；細(xì)胞CaN活性比色法定量檢測試劑盒購自GenMed；低糖DMEM干粉、購自Gibco；新生牛血清(new-born calf serum, NCS)購自PAA；胰蛋白酶購自Amresco；蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail)、苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)、四甲基乙二胺(tetramethyl ethylene diamine，TEMED)、Tris堿、Tris-HCl、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)、考馬斯亮藍(lán)G250、過硫酸銨、甘氨酸、亮肽酶素和Triton X-100購自Sigma；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、β-巰基乙醇購自Merck；蛋白電泳分子量(7～175 kD)為Bio-Rad產(chǎn)品；兔抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗人Bax、 Bcl-2和CaN多克隆抗體購自Cell Signal；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Santa Cruz；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)試劑盒購自Millipore；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000及Opti-MEM購自Invitrogen；pCDB-CaN質(zhì)粒由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心構(gòu)建；CaN抑制劑FK506購自Sigma。

2乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

參照Simpson等[8]法加以改進(jìn)，無菌操作取出生后24 h內(nèi)SD新生乳鼠心尖部組織，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入適量0.15% 胰蛋白酶，37℃水浴下輕柔攪動、反復(fù)消化，制備心肌細(xì)胞懸液，差速貼壁。用含15% 新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每瓶3×106個細(xì)胞，接種于底面積為75 cm2的培養(yǎng)瓶，置CO2孵箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。

3實(shí)驗(yàn)分組

取原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，置于CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，換無新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液同步化24 h后，隨機(jī)分組如下(進(jìn)行4次原代培養(yǎng)，分別接種，n=4)：(1)正常對照(control)組：細(xì)胞置CO2孵箱37℃，常規(guī)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;(2)H/R組：按本室報道的方法[3]將細(xì)胞置于缺氧倉內(nèi)，通入95% N2-5% CO2混合氣4 h，更換37 ℃ 95%空氣-5%CO2預(yù)平衡的10% NCS DMEM，37 ℃、5% CO2孵箱常氧繼續(xù)培養(yǎng)12 h結(jié)束實(shí)驗(yàn);(3)藥物預(yù)處理(PQS+H/R)組：以PBS緩沖液稀釋PQS原粉，配成濃度為160 g/L的儲存液，過濾除菌，4 ℃保存，應(yīng)用時將儲存液1 000倍稀釋加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行H/R操作;(4)CaN過表達(dá)+藥物預(yù)處理(CaN+PQS+H/R)組：pCDB-CaN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6 h后，按照(3)組程序操作;(5)空載pCDB質(zhì)粒+藥物預(yù)處理 (pCDB+ PQS+H/R)組：空載pCDB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6 h后，按照(3)組程序進(jìn)行操作；(6)CaN抑制劑+藥物預(yù)處理 (FK506+PQS+H/R)組：培養(yǎng)基中加入FK506 (5 mg/L)，37 ℃預(yù)孵育10 min 后，按照(4)組操作。

4CaN過表達(dá)

以轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染pCDB-CaN質(zhì)粒至乳大鼠心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法如下：(1)轉(zhuǎn)染前1 d以104/cm2的密度接種，傳代培養(yǎng)心肌細(xì)胞；(2)轉(zhuǎn)染1 h前將細(xì)胞培養(yǎng)液換為Opti-MEM；(3)分別配制DNA-Mix和Lipo-Mix：將質(zhì)粒或Lipofectamine 2000加入Opti-MEM，小心混合后于室溫下靜置6 min，而后將DNA-Mix與Lipo-Mix均勻混合，室溫下靜置20 min后小心滴加入細(xì)胞；(4)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5～6 h后換為正常的DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

5心肌細(xì)胞凋亡率測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液制備單細(xì)胞懸液，按照測試盒方法分別加入染料Annexin V和propidium iodide (PI)，室溫下孵育5～15 min，以流式細(xì)胞儀 (BD FACSCalibur， Becton-Dickinson) 檢測細(xì)胞凋亡情況。

6心肌細(xì)胞CaN活性檢測

細(xì)胞以每瓶3×105個細(xì)胞的濃度接種于25 cm2規(guī)格培養(yǎng)瓶，胰酶消化法收集細(xì)胞并加入3 mL預(yù)冷的GENMED清理液(Reagent A)，混勻細(xì)胞， 3 000×g4 ℃ 離心5 min，棄上清，加入500 μL GENMED裂解液(Reagent B)，充分混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL EP管中，強(qiáng)力渦旋振蕩15 s后置于冰槽里孵育30 min，13 000 r/min 4 ℃ 離心5 min，收集上清液，移取10 μL進(jìn)行蛋白定量，余樣本即可放進(jìn)-80 ℃冰箱保存或置于冰槽里參照試劑盒操作說明進(jìn)行CaN活性測定。

7Westernblotting分析

按本室報道方法[9]提取心肌細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，-80 ℃保存。取上述細(xì)胞蛋白提取液上清 (含蛋白80 μg) 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，12%分離膠)，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉40 min后分別加入Bcl-2、Bax、CaN多克隆抗體(均為1∶500) 4 ℃過夜孵育，用1×TBS-T洗膜后，以相應(yīng)的II抗孵育1.5 h，并以GAPDH (1∶500) 單克隆抗體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過程，作為上樣對照?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯示，采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值 (integratedAvalue，IA， 平均吸光度值×面積)，以靶蛋白/GAPDHIA比值反映靶蛋白水平。

8統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，采用單因素方差分析 (One-way ANOVA) 進(jìn)行多組間比較，采用q檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較，兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1CaN表達(dá)對PQS心肌細(xì)胞保護(hù)作用的影響

1.1心肌細(xì)胞凋亡率正常對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，凋亡率為2.0%；CaN過表達(dá)組心肌細(xì)胞凋亡率為6.6% (P<0.05)；以160 mg/L濃度的PQS預(yù)先培養(yǎng)24 h，細(xì)胞凋亡率為3.1%，與PQS+H/R組比較，CaN過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率升高3.5% (P<0.05)；FK506對于PQS改善H/R后心肌細(xì)胞凋亡率無明顯影響，與PQS+H/R組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

Figure 1. Flow cytometry analysis of the effect of CaN on cardiomyocyte apoptosis. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

圖1流式細(xì)胞術(shù)分析CaN對心肌細(xì)胞凋亡的影響

1.2凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)采用Western blotting檢測凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CaN質(zhì)粒后，與PQS+H/R組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)降低50.0%，而Bax蛋白表達(dá)為PQS+H/R組的2.0倍 (P<0.05)；FK506對于PQS改善H/R后心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)無明顯影響，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)與PQS+H/R組比較無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

2PQS對心肌細(xì)胞CaN活性及蛋白表達(dá)的影響

2.1心肌細(xì)胞CaN活性測定采用比色法測定CaN活性，結(jié)果顯示,H/R誘導(dǎo)CaN活性明顯增加，為對照組的10.0倍 (P<0.05)。PQS明顯抑制H/R引起的CaN活性升高，較H/R 組降低70.6%(P<0.05)；轉(zhuǎn)染CaN質(zhì)粒后，與PQS+H/R組比較，CaN活性升高3.0倍 (P<0.05)；FK506對于PQS改善H/R后心肌細(xì)胞CaN活性無明顯影響，與PQS+H/R組比較無顯著差異 (P>0.05)，見圖3。

2.2心肌細(xì)胞CaN蛋白表達(dá)采用Western blotting檢測CaN蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示， H/R誘導(dǎo)CaN蛋白表達(dá)明顯升高，為對照組的3.0倍 (P<0.05)。

Figure 2. Effects of calcineurin on the expression of Bcl-2 and Bax in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

圖2CaN對心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Figure 3. Effect of PQS on CaN activity in cardiomyocytes. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

圖3PQS對心肌細(xì)胞CaN活性的影響

PQS明顯抑制H/R引起的CaN蛋白表達(dá)升高，較H/R 組降低60.9% (P<0.05)；轉(zhuǎn)染CaN質(zhì)粒后，與PQS+H/R組比較，CaN蛋白表達(dá)升高2.3倍(P<0.05)；FK506對于PQS改善H/R后心肌細(xì)胞CaN蛋白表達(dá)無明顯影響，與PQS+H/R組比較無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

討　　論

近年來隨著臨床冠脈內(nèi)溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠脈腔內(nèi)血管成形術(shù)及冠脈搭橋術(shù)等治療方法的廣泛應(yīng)用，心肌再灌注損傷愈來愈引起人們的重視。I/R損傷指缺血一定時間的心肌恢復(fù)灌流后，組織損傷反而進(jìn)行性加重，心肌細(xì)胞從可逆損傷轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡鎿p傷的現(xiàn)象。I/R發(fā)生的主要環(huán)節(jié)是氧自由基產(chǎn)生和鈣超載，其機(jī)制尚未完全闡明，CaN是唯一依賴于Ca2+調(diào)控的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。CaN在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及其它病理過程中起著重要作用，參與心肌肥大、心肌凋亡、血管平滑肌細(xì)胞增殖等過程的調(diào)節(jié)。心肌細(xì)胞壞死和凋亡是心肌I/R損傷的特征之一[10]。Musat-Marcu等[11]在離體灌流大鼠心臟上發(fā)現(xiàn)，再灌注早期即可發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡。其中抗凋亡基因bcl-2與促凋亡基因bax參與了心肌I/R損傷中細(xì)胞凋亡的調(diào)控[12]。研究證明I/R時胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，引起CaN活化，通過Bad(Bcl-2家族促凋亡因子)去磷酸化拮抗Bcl-2的抗凋亡功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。Bueno等[14]發(fā)現(xiàn)CaNAβ基因打靶小鼠易致急性缺血誘發(fā)的心肌凋亡，從而推測CaN信號途徑可介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；Singh等[15]發(fā)現(xiàn)I/R時，腎素-血管緊張素系統(tǒng)被激活，釋放大量兒茶酚胺，可通過β1受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；李文霞等[16]發(fā)現(xiàn)CaN過表達(dá)可以增加I/R損傷心肌細(xì)胞凋亡率。Ikeda等[17]與Nathan等[18]研究證實(shí)，心肌與腦I/R損傷均可導(dǎo)致CaN活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌損傷，以CaN抑制劑CsA抑制其活性及表達(dá)可對I/R產(chǎn)生保護(hù)作用。

Figure 4. Effect of PQS on CaN protein expression in cardiomyocytes. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

圖4PQS對心肌細(xì)胞CaN蛋白表達(dá)的影響

本研究利用乳鼠心肌細(xì)胞H/R模型，采用流式細(xì)胞術(shù)以及Western blotting方法，證實(shí)外源性CaN過表達(dá)后能明顯增加心肌細(xì)胞凋亡率，升高促凋亡蛋白Bax表達(dá)及降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，提示CaN具有促心肌細(xì)胞凋亡作用，與文獻(xiàn)報道一致[19-20]，課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)PQS能明顯減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡，本研究表明聯(lián)合給予CaN抑制劑組與單純PQS預(yù)處理組一樣均能降低心肌細(xì)胞凋亡率，但2組相比無明顯差異，提示CaN活性抑制可以減少心肌細(xì)胞凋亡，但并未加強(qiáng)PQS對H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。 本研究按CaN測試盒步驟測定心肌細(xì)胞CaN活性，以Western blotting方法，檢測心肌細(xì)胞CaN表達(dá)，發(fā)現(xiàn)H/R誘導(dǎo)CaN活性及蛋白表達(dá)明顯增加，PQS明顯抑制H/R引起的CaN活性升高及蛋白表達(dá)，單純PQS預(yù)處理組與聯(lián)合給予CaN抑制劑組均能降低心肌細(xì)胞CaN活性及蛋白表達(dá)，但2組相比無明顯差異，提示CaN活性抑制對于PQS改善H/R后心肌細(xì)胞CaN活性及蛋白表達(dá)無明顯影響。

綜上所述，心肌細(xì)胞H/R損傷可以導(dǎo)致CaN活性及蛋白表達(dá)增加，增加心肌細(xì)胞凋亡，F(xiàn)K506抑制CaN活性可以減輕心肌細(xì)胞H/R損傷，CaN活性抑制對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用不比單獨(dú)應(yīng)用PQS強(qiáng)，提示PQS減輕心肌細(xì)胞H/R損傷的機(jī)制可能與CaN途徑無關(guān)。

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