楊明明，陳玉林

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院 陜西 楊凌 712100)

枯草芽孢桿菌是廣泛存在于土壤和動物胃腸道的一類革蘭氏陽性菌,因其易于分離培養(yǎng)，具有較清晰的遺傳背景和良好的分泌性，又無致病性等特點(diǎn)，已成為重要的工業(yè)菌種，被越來越多地應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中[1-3]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)飼用酶、飼用活性代謝產(chǎn)物以及作為腸道益生菌成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。然而，本研究領(lǐng)域經(jīng)過近十年的發(fā)展，雖然已有一些可用于枯草芽孢桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，但仍存在如嵌合載體拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)化方法效率低、啟動子活性低、目標(biāo)基因表達(dá)量低等問題，嚴(yán)重限制了枯草芽孢桿菌在飼用酶和益生菌工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用和發(fā)展[4-6]。本文將對枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的載體和啟動子元件作一簡要綜述，以期為飼用枯草芽孢桿菌的表達(dá)系統(tǒng)研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)材料。

1 枯草芽孢桿菌的表達(dá)系統(tǒng)概述

枯草芽孢桿菌作為研究革蘭氏陽性菌的模式菌，具有遺傳和生理生化背景清晰、蛋白分泌性好和非致病性的特點(diǎn)，被認(rèn)為是生物安全級別的微生物，目前作為重要的益生菌和飼用酶生產(chǎn)菌種，在飼料工業(yè)中被廣泛利用[1-2]。

隨著現(xiàn)代DNA重組技術(shù)的發(fā)展和枯草芽孢桿菌全基因組DNA測序的完成，枯草芽孢桿菌基因工程得到了進(jìn)一步的發(fā)展。其作為基因工程菌的出發(fā)菌具有巨大潛力和優(yōu)勢[6-8],主要是因?yàn)椋孩?非致病性，廣泛存在于動物腸道微生物區(qū)系，被認(rèn)為是動物腸道益生菌；② 具有易于攝取外源DNA的特點(diǎn)，噬菌體和質(zhì)粒都可以用作克隆載體，便于 DNA 的遺傳操作；③ 枯草芽孢桿菌分泌蛋白種類多，蛋白分泌系統(tǒng)功能完善，當(dāng)分泌蛋白跨過細(xì)胞膜后，可直接釋放到培養(yǎng)基中，用于飼用酶生產(chǎn)時(shí)，回收和純化方法簡單；④ 培養(yǎng)基配方簡單，發(fā)酵技術(shù)成熟，益生菌和飼用酶的工業(yè)化生產(chǎn)容易實(shí)現(xiàn)；⑤ 細(xì)胞壁組成簡單，只含有肽聚糖和磷壁酸，因此在飼用酶產(chǎn)品中不含內(nèi)毒素(熱源性脂多糖)，在飼用酶的生產(chǎn)上具有極大的優(yōu)勢。

采用枯草芽孢桿菌的高效表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)有生產(chǎn)價(jià)值蛋白的高產(chǎn)，是現(xiàn)代飼用酶和重組益生菌的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[9]。目前，在原核微生物中，大腸桿菌的分子生物學(xué)研究發(fā)展最早，表達(dá)系統(tǒng)相對完善[10]。典型表達(dá)系統(tǒng)主要有Lac啟動子、Tac 啟動子、PL啟動子、PR啟動子和T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)等[11-14]。

與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，枯草芽孢桿菌的遺傳操作體系還很不完善，這極大地限制了枯草芽孢桿菌基因工程技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[4-6,15]。

值得注意的是，枯草芽孢桿菌的基因表達(dá)具有自身的特點(diǎn)，在對數(shù)生長期后逐漸進(jìn)入芽孢形成期，在不同的生長階段基因表達(dá)不同，具有不同時(shí)序性的多種Sigma因子[16-17]。Sigma因子是RNA聚合酶全酶(α 2 β β')的 5個亞基之一，它協(xié)助核心酶識別特定的啟動子序列，并結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始部位。目前，關(guān)于枯草芽孢桿菌sigma因子，已知的不少于11種。另外，枯草芽孢桿菌能將蛋白大量分泌至培養(yǎng)基中。通過生物信息學(xué)預(yù)測，枯草桿菌有將近200個潛在的信號肽序列，目前已有147得到驗(yàn)證，正是信號肽介導(dǎo)了蛋白的胞外分泌[15,18-19]?？莶輻U菌有強(qiáng)的胞外蛋白分泌能力，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。但是由于自身胞外蛋白酶表達(dá)量大，容易引起目標(biāo)蛋白的降解，目前通常的解決方法是采用蛋白酶缺陷株作為宿主[20]。然而，枯草芽孢桿菌能自發(fā)形成感受態(tài)的菌株極少，感受態(tài)持續(xù)時(shí)間短暫，分子克隆效率低限制了它的遺傳操作。且與大腸桿菌相比，枯草桿菌中遺傳操作方法不完善，基因工程構(gòu)建難度較大，導(dǎo)致了現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)的資源少且不成熟。

目前，在枯草芽孢桿菌中常用的表達(dá)系統(tǒng)是Pspac和Pxyl啟動子系統(tǒng)。Pspac啟動子采用枯草芽孢桿菌噬菌體sp01的啟動子和lac操縱元的調(diào)節(jié)基因嵌合構(gòu)建而成，其構(gòu)建參考了大腸桿菌Tac啟動子的構(gòu)建思路，利用了lac操縱元的調(diào)節(jié)基因，從而可以用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控[21-24]。但與大腸桿菌的啟動子系統(tǒng)相比，其調(diào)控的精確性較差，表達(dá)強(qiáng)度較弱；Pxyl啟動子系統(tǒng)則是利用木糖操縱元啟動子構(gòu)建而成，該系統(tǒng)以木糖為誘導(dǎo)物激活轉(zhuǎn)錄。這兩個誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)目前在枯草桿菌的研究工作中應(yīng)用較廣，但Pspac系統(tǒng)的誘導(dǎo)物IPTG對宿主有毒性，而Pxyl啟動子系統(tǒng)的誘導(dǎo)物木糖價(jià)格昂貴，因而限制了它們在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[25-27]。可見，缺乏成熟有效的調(diào)控元件，是枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)不完善的重要原因之一。

2 枯草芽孢桿菌載體

在微生物的遺傳操作中，質(zhì)粒是進(jìn)行基因克隆和表達(dá)的基本工具[28-30]?？莶菅挎邨U菌內(nèi)源性質(zhì)粒DNA很少，目前在枯草芽孢桿菌遺傳操作中使用的質(zhì)粒DNA大部分來源于葡萄球菌(staphylococci)和鏈球菌(streptococci)等其他微生物[31-36]。這些質(zhì)粒依據(jù)其復(fù)制類型可以分為蝶形復(fù)制型(θ復(fù)制型)和滾環(huán)復(fù)制型質(zhì)粒[37-40]。

θ復(fù)制型質(zhì)粒較大，拷貝數(shù)很低，難以方便地用于遺傳操作[41]。滾環(huán)復(fù)制型質(zhì)粒大多為小型質(zhì)粒(﹤10 Kbp)，通常采用以解鏈的單鏈DNA(ssDNA)為中間體進(jìn)行復(fù)制。這類質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)制、結(jié)構(gòu)域和功能特點(diǎn)具有高度的相似性，它們通常具備以下功能區(qū)域：抗性基因(隱性質(zhì)粒缺乏該功能區(qū))，主要復(fù)制單元，次要復(fù)制起始點(diǎn)和一個開放性閱讀框。雖然這4個功能區(qū)在不同的質(zhì)粒中可能排列順序有差異，但相應(yīng)的功能區(qū)的DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)具有高度同源性。

主要復(fù)制功能單元(最小復(fù)制子)由編碼復(fù)制起始蛋白(Rep)的基因和復(fù)制起始點(diǎn)(正鏈合成起始點(diǎn)，ori )組成；次要復(fù)制功能單元，又稱負(fù)鏈起始點(diǎn)(MO)，是合成負(fù)鏈的起始點(diǎn)。MO對于負(fù)鏈合成有重要影響，質(zhì)粒缺乏MO時(shí)，細(xì)胞內(nèi)單鏈DNA的水平大量增加，而單鏈DNA的積累通常會加劇質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。目前所知道的MO主要有三個家族，即palA型，palU型和palT型。palA型MO在枯草桿菌中沒有功能，在枯草桿菌中具有不穩(wěn)定性。palU型(又稱BA3型)MO在枯草桿菌中有功能，相對比較穩(wěn)定。palT型MO在枯草桿菌中有功能，并因?yàn)橛幸欢ǚN屬親緣性，因此作為枯草桿菌的穩(wěn)定性質(zhì)粒。

枯草芽孢桿菌中常用的滾環(huán)復(fù)制型質(zhì)粒主要有以下幾種。

2.1 來源于金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒

pUB110是一個被完全測序的質(zhì)粒(4 548 bp)，抗性基因?yàn)榭敲顾?或新霉素)和博萊霉素。該質(zhì)粒的拷貝數(shù)約為50個/染色體，相對穩(wěn)定[42-43]。但pUB110的一些衍生質(zhì)粒，如pBD64和pLB2/pLB5，往往因?yàn)槿鄙費(fèi)O,而造成高度的結(jié)構(gòu)和分離不穩(wěn)定性，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。

pC194質(zhì)粒大小為2 906 bp，拷貝數(shù)約為15個/染色體[44]。質(zhì)粒較小，利于克隆，但是由于是palA型MO，容易產(chǎn)生大量的ssDNA，且在插入異源片段時(shí)還會產(chǎn)生大量高分子量畸形復(fù)制產(chǎn)物(HMWDNA)，造成了它的高度不穩(wěn)定性，也不適合用于分子操作。

pE194質(zhì)粒大小為3 728 bp，拷貝數(shù)大約10個/染色體，其衍生質(zhì)粒cop-6，拷貝數(shù)可達(dá)100個/染色體，拷貝數(shù)高，但由于也是palA型MO，所以在枯草桿菌中很不穩(wěn)定[45]。

pE194質(zhì)粒的復(fù)制具有溫度誘導(dǎo)性，正常復(fù)制溫度為32 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的增加，質(zhì)?？截悢?shù)下降，溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制停止。pE194 Ts是質(zhì)粒pE194的突變體，其在38 ℃就喪失了復(fù)制功能。利用該質(zhì)粒的溫度敏感性，可以實(shí)現(xiàn)在枯草桿菌染色體DNA中多位點(diǎn)整合。通過改變溫度條件，使得目標(biāo)基因在染色體DNA中多拷貝整合，得到遺傳穩(wěn)定性高的重組菌。但由于操作步驟相對復(fù)雜，所以在實(shí)際的遺傳操作中應(yīng)用較少。

2.2 來源于干燥棒狀桿菌的高拷貝質(zhì)粒

pTZ12(約2 517 bp)是一個編碼氯霉素抗性基因，來源于corynebacterium xerosis的質(zhì)粒[46]。 pTZ12能夠在枯草桿菌中復(fù)制并保持高的拷貝數(shù)(大約150～200個/染色體)。pGDV1是pTZ12的衍生質(zhì)粒，在pGDV1中引入了pUC18的多克隆位點(diǎn)便于基因的克隆[47-50]。 pGDV1也是一個高拷貝的質(zhì)粒，但因?yàn)樗诖竽c桿菌中無法復(fù)制，而枯草桿菌轉(zhuǎn)化效率相對較低，分子操作不便，所以需要將它進(jìn)一步構(gòu)建為大腸桿菌——枯草芽孢桿菌穿梭載體，以求在研究中更加方便高效地應(yīng)用。

2.3 來源于乳酸菌的質(zhì)粒

基于小型乳酸菌隱性質(zhì)粒pWV01(2 178 bp)，及與之高度相近的質(zhì)粒pSH71，構(gòu)建了一系列靈活方便的小型質(zhì)粒載體[51-52]。但是這兩個質(zhì)粒及它們的衍生質(zhì)粒在枯草桿菌中的拷貝數(shù)都很低，不便于分子操作。

2.4 來源于桿菌的質(zhì)粒

來源于桿菌屬的質(zhì)粒因?yàn)榕c枯草芽孢桿菌種屬的接近，可以形成相對穩(wěn)定的宿主-質(zhì)粒系統(tǒng)，如質(zhì)粒pTA1060，pLS11和pBAA1，以及和pUB110復(fù)制功能極為相似的pBC16[53-54]?？墒?，這些質(zhì)粒仍有一些自身缺陷，如pTA1060穩(wěn)定性較好，但質(zhì)粒偏大(8.6 k)，且在枯草桿菌中拷貝數(shù)低至5個/染色體，限制了其在枯草芽孢桿菌遺傳操作中的應(yīng)用。它的小型衍生質(zhì)粒pHP13(4.9 bp)帶紅霉素和氯霉素抗性，插入的pUC9的lacZ基因使它可以在大腸桿菌中方便的篩選，在枯草芽孢桿菌限制性缺陷株中有較高的克隆效率，是一個有用的大腸-枯草桿菌穿梭載體，但它依然存在拷貝數(shù)低的問題，不便于廣泛應(yīng)用。

以上質(zhì)粒雖然能夠在枯草桿菌中進(jìn)行克隆操作，但他們普遍存在質(zhì)粒的不穩(wěn)定性問題[31,33,36]。質(zhì)粒的不穩(wěn)定性包括分離不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。分離不穩(wěn)定是指在宿主生長分裂過程中質(zhì)粒丟失，而結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是質(zhì)粒在復(fù)制過程中由于自身重排造成缺失。滾環(huán)復(fù)制型質(zhì)粒在復(fù)制中產(chǎn)生單鏈DNA (ssDNA)分子和高分子量畸型復(fù)制產(chǎn)物(HMW DNA)，這是造成這兩類不穩(wěn)定性的重要因素。

質(zhì)粒的不穩(wěn)定性嚴(yán)重限制了其在研究工作中的實(shí)際應(yīng)用，而且在革蘭氏陽性菌的遺傳操作中，體外連接的雙鏈質(zhì)粒DNA分子直接轉(zhuǎn)化宿主效率極低[38-39]。由此造成了枯草桿菌中分子遺傳操作的極大不便，使得目標(biāo)基因難以直接在枯草桿菌中克隆和表達(dá)。而大腸桿菌的質(zhì)粒系統(tǒng)和操作技術(shù)比較完善，質(zhì)粒的穩(wěn)定性好。因此，采用大腸桿菌—枯草芽孢桿菌穿梭載體的策略，前期的基因克隆在大腸桿菌中進(jìn)行，然后再轉(zhuǎn)化入枯草桿菌中，是一個行之有效的方式。而且，穿梭載體還有利于進(jìn)行兩個菌在基因表達(dá)和蛋白分泌等方面的比較性研究，對研究兩個菌的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移也很有意義。因此，大腸桿菌—枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體是建立枯草桿菌遺傳操作體系的重要基礎(chǔ)。

3 枯草芽孢桿菌啟動子

原核微生物的啟動子通常包含 -10序列、-35序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等保守型元件。-10區(qū)和 -35區(qū)之間的距離影響基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，大部分原核啟動子的 -10和 -35區(qū)域的間距為16～19 bp，當(dāng)間距超過這一范圍時(shí)啟動子的強(qiáng)度不同程度降低或失去活性[55-57]。但在原核微生物中亦存在缺乏 -35或 -10的啟動子，在輔助蛋白質(zhì)作用下，RNA聚合酶才能識別這種啟動子[58-59]。除了 -10和 -35序列，其附近的DNA序列也能影響啟動子的強(qiáng)度。在枯草芽孢桿菌的一些啟動子 -35區(qū)上游含有豐富AT的堿基對，通過刪除或突變試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AT富含區(qū)增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，稱之為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)。在啟動子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的 -10區(qū)到 +1之間轉(zhuǎn)載另一個AT富含區(qū)，一般為4～7 bp，該區(qū)域在轉(zhuǎn)錄起始時(shí)促進(jìn)DNA的局部解鏈[60]。

3.1 組成型啟動子

組成型啟動子即持續(xù)性表達(dá)蛋白的啟動子，可用作調(diào)控元件構(gòu)建表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的胞內(nèi)或胞外大量表達(dá)，如P43啟動子[61-62]。此外，在枯草芽孢桿菌的遺傳操作中蛋白酶的基因的調(diào)控序列、α-淀粉酶基因的啟動子常被用作分泌表達(dá)的調(diào)控元件。組成型啟動子通常表達(dá)量較高，成本較低，但存在對宿主生長有害的蛋白難以和表達(dá)可控性差的缺陷[63-64]。

3.2 誘導(dǎo)型啟動子

與組成型啟動子相比，誘導(dǎo)型啟動子具有快速開啟或關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄等獨(dú)特優(yōu)勢，可以根據(jù)需要，調(diào)控基因的表達(dá)。根據(jù)誘導(dǎo)方式，這類啟動子可以分為兩種：環(huán)境應(yīng)答型啟動子和化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子。環(huán)境應(yīng)答型啟動子在特殊環(huán)境下(如熱休克、高鹽和缺氧等)，可啟動基因的轉(zhuǎn)錄，使微生物能快速的適應(yīng)環(huán)境的變化[65-66]?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動子則由誘導(dǎo)物來調(diào)控基因的表達(dá)[21,24]。

化學(xué)誘導(dǎo)啟動子在化學(xué)誘導(dǎo)物存在時(shí)，改變基因的轉(zhuǎn)錄水平。通?；瘜W(xué)誘導(dǎo)物與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活或抑制目的基因的表達(dá)。理想的化學(xué)誘導(dǎo)啟動子在無誘導(dǎo)物時(shí)啟動子無轉(zhuǎn)錄活性或表現(xiàn)低轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)誘導(dǎo)物應(yīng)該具有快速應(yīng)答效應(yīng)、誘導(dǎo)的專一性和無毒或低毒[21,24-25]。

在枯草芽孢桿菌的基因工程中，常用的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)有Pspac、Pxyl和PsacB系統(tǒng)等[21,65,67]。Pspac啟動子是一個雜合啟動子，由SPO1(枯草桿菌烈性噬菌體)的早期啟動子和大腸桿菌乳糖操縱元的阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)嵌合而成，在IPTG誘導(dǎo)下可實(shí)現(xiàn)高水平的表達(dá)；Pxyl啟動子是由來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的木糖操縱元構(gòu)建而成，包括木糖啟動子Pxyl和阻遏蛋白基因xylR。木糖誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白XylR結(jié)合，阻止了XylR對Pxyl啟動子轉(zhuǎn)錄的阻斷，從而誘導(dǎo)基因表達(dá)。該系統(tǒng)調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)，誘導(dǎo)效率高；PsacB 啟動子則是利用自身的可控元件來實(shí)現(xiàn)外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)。sacB啟動子和結(jié)構(gòu)基因之間有-莖環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為sacR區(qū)，是一個受蔗糖調(diào)控的轉(zhuǎn)錄終止序列。無蔗糖誘導(dǎo)時(shí)，轉(zhuǎn)錄終止；蔗糖誘導(dǎo)時(shí)，sacR區(qū)的轉(zhuǎn)錄終止作用就失效，啟動子激活。

這三個啟動子系統(tǒng)在枯草桿菌研究工作中應(yīng)用很廣，但它們也有自己的缺點(diǎn)：Pspac啟動子的誘導(dǎo)物IPTG不僅成本高，而且有毒性；Pxyl啟動子的誘導(dǎo)物木糖價(jià)格高，易增加生產(chǎn)成本；sacB啟動子的表達(dá)量相對比較低。這些缺陷使得它們在工業(yè)生產(chǎn)中有一定的局限性。

此外，枯草芽孢桿菌中的麥芽糖啟動子，也具有很好的應(yīng)用潛力[68]。該操縱元由編碼 6-磷酸-葡萄糖苷酶(GlvA)的基因，調(diào)控蛋白(YfiA，即GlvR)基因和磷酸烯醇丙酮酸酯—糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)透性酶(GlvC)基因以及它們的調(diào)控元件組成。GlvA蛋白由449個氨基酸組成，該酶需要NAD(H) 和二價(jià)金屬離子才能有活性；GlvR由254個氨基酸組成，其氨基酸序列和RpiR/YebK/YfhH家族有很高的相似性；GlvC含527個氨基酸，是一個有12個跨膜區(qū)域的PTS轉(zhuǎn)運(yùn)酶。培養(yǎng)基中的麥芽糖在被GlvC轉(zhuǎn)運(yùn)入枯草芽孢桿菌胞質(zhì)的同時(shí)被磷酸化成為6-磷酸麥芽糖，GLVR與6-磷酸麥芽糖結(jié)合后被激活，從而與Pglv啟動子結(jié)合促進(jìn)了其轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。同時(shí)，6-磷酸麥芽糖可在胞內(nèi)被GlvA水解成6-磷酸葡萄糖，而在Pglv啟動子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)之間，有一個典型的代謝反應(yīng)元件cre序列(catabolite repression elements)，因而葡萄糖特異性反饋抑制麥芽糖操縱元的轉(zhuǎn)錄。

Pglv系統(tǒng)的誘導(dǎo)物麥芽糖相對于IPTG和木糖來說，價(jià)格便宜，成本低，且對細(xì)菌本身無毒性，因此在工業(yè)生產(chǎn)上很有實(shí)用性價(jià)值。但其同時(shí)也存在著不足，即發(fā)酵代謝產(chǎn)物葡萄糖對麥芽糖啟動子有強(qiáng)烈的反饋抑制作用，這是對該啟動子元件應(yīng)用應(yīng)用的一個重大制約。

4 枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)的現(xiàn)狀及發(fā)展方向

基因表達(dá)是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，枯草桿菌的基因表達(dá)具有以下特點(diǎn)：①枯草桿菌及其噬菌體在不同生長時(shí)期或不同生長環(huán)境中，所表達(dá)基因的種類和程度各不相同；②轉(zhuǎn)錄多σ因子。這些σ因子是級聯(lián)式交替進(jìn)行作用的，符合σ因子級聯(lián)基因調(diào)控模型；③枯草桿菌中有多種信號肽，因此蛋白可大量跨膜分泌至培養(yǎng)基中。

4.1 現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

完善的枯草芽孢桿菌胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該包括兩個方面：穩(wěn)定且高拷貝的載體骨架及可控性好的強(qiáng)啟動子[23,28-30]。

在載體骨架方面，如前文所述，枯草芽孢桿菌常用質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性和質(zhì)粒大小有關(guān)(如pUB110類質(zhì)粒載體)，當(dāng)質(zhì)粒載體太大會引起分離不穩(wěn)定。而在實(shí)際操作中，為了讓質(zhì)粒載體變小，在枯草桿菌中有功能的palU型MO常被刪掉，增加了質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中的分離不穩(wěn)定。而由枯草桿菌隱性質(zhì)粒與大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)成的嵌合載體, 如由枯草桿菌隱性質(zhì)粒pTA1060與pUC19構(gòu)成的穿梭質(zhì)粒pHB201，雖然相對較穩(wěn)定，但拷貝數(shù)低(5個/染色體)，這限制了它的表達(dá)量；采用整合質(zhì)粒將克隆基因整合到宿主染色體是克服枯草桿菌質(zhì)粒不穩(wěn)定性的一個有效途徑，但是它也同樣存在拷貝數(shù)低和表達(dá)量低的問題。

在啟動子方面，組成型啟動子P43，誘導(dǎo)型啟動子Pspac，Pxyl和PsacB都是可以應(yīng)用的啟動子[21,25-26,67]，但也有各自的缺點(diǎn)。

胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)是構(gòu)建工業(yè)化生產(chǎn)基因工程菌的基礎(chǔ)?；蛑亟M即將天然或人工合成的目的基因，克隆到表達(dá)載體上，然后將重組DNA分子導(dǎo)入到宿主菌中，從而得到目標(biāo)蛋白高效表達(dá)的生產(chǎn)菌株。因此，構(gòu)建可方便操作且穩(wěn)定性好的載體骨架；篩選調(diào)控精準(zhǔn)，誘導(dǎo)物安全低廉的強(qiáng)啟動子元件，對于發(fā)展枯草桿菌的基因工程，獲得高效的工業(yè)化生產(chǎn)菌種，具有至關(guān)重要的作用。

4.2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展趨勢和展望

近年來，隨著枯草芽孢桿菌基因工程的發(fā)展和完善，各種與工業(yè)發(fā)酵有關(guān)的基因獲得成功表達(dá)，如乙醇、有機(jī)酸醇、氨基酸、維生素等合成途徑的調(diào)控基因和關(guān)鍵酶基因；很多飼用酶獲得高效表達(dá)，如中性蛋白酶和淀粉酶等。

外源基因在枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的必要條件。目前，枯草芽孢桿菌中應(yīng)用最廣泛的宿主菌株是容易進(jìn)行感受態(tài)轉(zhuǎn)化的168菌株及其突變體。這些突變體包括各種營養(yǎng)要求、芽孢形成和萌發(fā)、蛋白酶缺失、重組缺陷、限制/修飾系統(tǒng)缺陷、轉(zhuǎn)座子插入等方面的突變體?？莶菅挎邨U菌168菌株的全基因組測序已于1997年完成，可方便地進(jìn)行查詢和比對[68]。

可以預(yù)見，隨著基因工程的進(jìn)一步發(fā)展，枯草桿菌的表達(dá)系統(tǒng)將會按新的思路改進(jìn)并具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

(1)更小，拷貝數(shù)更高的質(zhì)粒載體的構(gòu)建。在保證全部復(fù)制功能的前提下，質(zhì)粒越小，分子克隆越方便，而拷貝數(shù)的高低是決定表達(dá)量的關(guān)鍵，因此構(gòu)建小而且高拷貝的質(zhì)粒是實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的重要基礎(chǔ)。

(2)質(zhì)粒的穩(wěn)定性和安全性將進(jìn)一步提高。隨著基礎(chǔ)研究和操作手段的進(jìn)一步深入，質(zhì)粒的穩(wěn)定性問題將會進(jìn)一步得到解決。例如目前新的研究方向-無抗性標(biāo)記系統(tǒng)，可以考慮將宿主的某必需基因敲除，而用質(zhì)粒載體攜帶該基因轉(zhuǎn)化入宿主菌，這樣由于宿主菌只有在此質(zhì)粒存在時(shí)才能存活，從而保證了穩(wěn)定的宿主-質(zhì)粒系統(tǒng)。同時(shí)，這樣可以省略轉(zhuǎn)化時(shí)的抗性標(biāo)記，因?yàn)榇婊畹木瓯厝缓写速|(zhì)粒，這樣在培養(yǎng)基中就不必加入抗生素，這即可降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，又可以減少抗性基因?qū)Νh(huán)境的污染。

(3)遺傳操作方法的進(jìn)一步優(yōu)化?？莶輻U菌中的遺傳操作方法不如大腸桿菌中完善，尤其轉(zhuǎn)化效率低，更是分子操作中的瓶頸問題。由于枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比革蘭氏陰性菌復(fù)雜，故其轉(zhuǎn)化條件要求更苛刻，且操作較為繁瑣。因此進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法，使其能更方便高效，具有重要的意義。

(4)調(diào)控方式更簡單有效的表達(dá)系統(tǒng)的建立。例如采用壓力調(diào)控系統(tǒng)，通過溫度，滲透壓，氧濃度等方式來調(diào)控，誘導(dǎo)方式簡單而成本低。這需要進(jìn)一步對相關(guān)表達(dá)元件及其調(diào)控方式進(jìn)行研究，在功能研究清楚的基礎(chǔ)上加以有效的應(yīng)用。

(5)強(qiáng)啟動子的篩選。這需要對枯草桿菌以及其他相關(guān)菌株的啟動子進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)性的篩選和鑒定，從而得到更好的表達(dá)元件，這也是實(shí)驗(yàn)性地驗(yàn)證枯草桿菌基因組調(diào)控元件的重要途徑。

(6)高效分泌系統(tǒng)的建立。在好的表達(dá)載體骨架的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)性地研究信號肽與特定目的基因的適配性，從而找出最適合的信號肽，最終實(shí)現(xiàn)外源基因在枯草桿菌的高效分泌表達(dá)。這對于枯草桿菌的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] Bolhuis A, Sorokin A, Azevedo V,et al.Bacillus subtilis can modulate its capacity and specificity for protein secretion through temporally controlled expression of sips gene for signal peptidase I[J]. Mol Microbiol,1996,22:605-618.

[2] Bron S. Plasmids[M]//Harwood C R, Cutting S M.Molecular biological methods for Bacillus. New York:John Wiley and Sons,1990:75-174.

[3] Bron S, Bolhuis A, Tjalsma H,et al. Protein secretion and possible role for multiple signal peptidases for precursor processing in Bacilli[J]. J Biotechnol,1998,64:3-13.

[4] 沈衛(wèi)鋒,牛寶龍,翁宏飚,等.枯草芽孢桿菌作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005，17(14):234-238.

[5] 鄒立扣,王紅寧,潘 欣. 枯草芽孢桿菌整合載體研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊,2003,14 (6) :525-527.

[6] Schallmey M, Singh A, Ward O P. Developments in the use of Bacillus species for industrial production[J]. Can J Microbiol,2004,50: 1- 17.

[7] Eugeni B, Agnieszka S, Francois L,et al. An updated metabolic view of the Bacillus subtilis 168 genome[J]. Microbiol,2013,159: 757-770.

[8] Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis[J]. Nature,1997,390: 249-256.

[9] Schumann W.Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis[J].Adv Appl Microbiol,2007,62:137-189.

[10] Baneyx F.Recombinant protein expression in Escherichia coli[J]. Curr Opin Biotechnol,1999,10: 411-421.

[11] Hannig G, Makrides S C.Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli[J]. Trends Biotechnol,1998,16: 54-60.

[12] Hertz G Z, Stormo G D.Escherichia coli promoter sequences: analysis and prediction[J]. Methods Enzymol,1996,273:30- 42.

[13] Jonasson P, Liljeqvist S, Nygren P A,et al. Genetic design for facilitated production and recovery of recombinant proteins in Escherichia coli[J]. Biotechnol Appl Biochem,2002,35: 912-105.

[14] Nuc P, Nuc K.Recombinant protein production in Escherichia coli[J]. Postepy Biochem,2006,52: 4 482- 4 561.

[15] Li W F, Zhou X X, Lu P. Bottlenecks in the expression and secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis[J]. Res Microbiol,2004,155:605-610.

[16] Wang P Z, Doi R H.Overlapping promoters transcribed by Bacillus subtilis sigma 55 and sigma 37 RNApolymerase holoenzymes during growth and stationary phase[J]. J Biol Chem,1984,259: 8 619- 8 625.

[17] Staron A.The third pillar of bacterial signal transduction: classification of the extracytoplasmic function (ECF) sigma factor protein family[J]. Mol Microbiol,2009,74: 557-581.

[18] Zhang X Z, Cui Z L, Qing H,et al.High-Level Expression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis WB800[J]. Appl Environ Microbiol,2005,71: 4 101- 4 103.

[19] Zhu F M, Ji S Y, Zhang W W,et al.Development and application of a novel signal peptide probe vector with PGA as reporter in Bacillus subtilis WB700: twenty-four Tat pathway signal peptides from Bacillus subtilis were monitored[J]. Mol Biotechnol,2008, 39: 225-230.

[20] Wu S C, Wong S L.Engineering of a Bacillus subtilis strain with adjustable levels of intracellular biotin for secretory production of functional streptavidin[J]. Appl Environ Microbiol,2002,68: 1 102-1 108.

[21] Denise K, Andre C, Kai O, et al. xylA promoter of Bacillus megaterium mediates constitutive gene expression in Escherichia coli[J]. Eng Life Sci, 2011, 11: 458- 462.

[22] Girbal L, Mortier-Barrière I, Raynaud F,et al. Development of a sensitive gene expression reporter system and an inducible promoter-repressor system for Clostridium acetobutylicum[J]. Appl Environ Microbiol,2003, 69: 4 985- 4 988.

[23] Prax M, Lee C Y, Bertram R. An update on the molecular genetics toolbox for staphylococci. Microbiol,2013,159: 421-435.

[24] Rygus T, Hillen W.Inducible high-level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium using the regulatory elements of the xylose-utilization operon[J]. Appl Microbiol Biotechnol,1991,35: 594- 599.

[25] Bhavsar A P, Zhao X M, Brown E D.Development and characterization of a xylose-dependent system for cloned gene in Bacillus subtilis: conditional complementation of a Teichoic acid mutant[J]. Appl Environ Microbiol,2001,67: 403-410.

[26] Hartl B, Wehrl W, Wiegert T,et al. Development of a new integration site within the Bacillus subtilis chromosome and construction of compatible expression cassettes[J]. J Bacteriol,2001,183: 2 696-2 699.

[27] Kim L, Mogk A, Schumann W. A xylose inducible Bacillus subtilis integration vector and its application[J]. Gene,1996 181:71-76.

[28] Nguyen H D, Nguyen Q A, Ferreira R C,et al. Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability[J]. Plasmid,2005,54: 241-248.

[29] Nguyen H D, Phan T T, Schumann W. Expression vectors for the rapid purification of recombinant proteins in Bacillus subtilis[J]. Curr Microbiol,2005b，55: 89-93.

[30] Nguyen H D, Schumann W. Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis[J]. Prot Expr Purif,2006，46: 189-195.

[31] Becker E, Herrera N C, Gunderson F Q,et al.DNA segregation by the bacterial actin AlfA during Bacillus subtilis growth and development[J]. EMBO J,2006,25:5 919-5 931.

[32] Campbell C S ,Mullins R D.In vivo visualization of type II plasmid segregation: bacterial actin filaments pushing plasmids[J]. J Cell Biol,2007,179:1 059-1 066.

[33] Ehrlich S D, Bruand C, Sozhamannan S,et al. Plasmid replication and structural stability in Bacillus subtilis[J]. Res Microbiol,1991.142:869-873.

[34] Eijnenburg C M, Bron S, Venema G.Structural plasmid instability in recombination- and repair-deficient strains of Bacillus subtilis[J]. Plasmid,1987,17: 167- 170.

[35] Eima R, Venema G, Bron S.A positive selection vector for the analysis of structural plasmid instability in Bacillus subtilis[J]. Plasmid,1996,35: 14- 30.

[36] Teruo T. Functional Analysis of the Stability Determinant AlfB of pBET131, a Miniplasmid Derivative of Bacillus subtilis (natto) Plasmid pLS32[J]. J Bacteriol,2010,192: 1 221 - 1 230.

[37] Hoz A B, Ayora S, Sitkiewicz I,et al. Plasmid copy-number control and better-than-random segregation genes of pSM19035 share a common regulator[J]. Proc Natl Acad Sci,2000,97:728-733.

[38] Dmowski M, Sitkiewicz I, Ceglowski P. Characterization of a novel partition system encoded by the delta and omega genes from the streptococcal plasmid pSM19035[J]. J Bacteriol, 2006,188: 4 362-4 372.

[39] Garner E C, Campbell C S, Weibel D B,et al. Reconstitution of DNA segregation driven by assembly of a prokaryotic actin homolog[J]. Science,2007,315:1 270-1 274.

[40] Meijer W J, Boer A J,Van Tongeren S,et al.Characterization of the replication region of the Bacillus subtilis plasmid pLS20: a novel type of replicon[J]. Nucl Acids Res,1995,23: 3 214- 3 223.

[41] Van Belkum M J, Stiles M E. Characterization of the theta-type plasmid pCD3.4 from Carnobacterium divergens, and modulation of its host range by RepA mutation[J]. Microbiol,2006,152: 171-178.

[42] Jeanine A, Nadia L, Névine E S.Characterization of a Staphylococcal plasmid related to pUB110 and carrying two novel genes, vatC and vgbB, encoding resistance to streptogramins A and B and similar antibiotics[J]. Antimicrob Agents Chemother,1998,42:1 794-1 798.

[43] Maciag I E, Viret J F, Alonso J C.Replication and incompatibility properties of plasmid pUB110 in Bacillus subtilis[J]. Mol Gen Genet,1988,212: 232-240.

[44] Alonso J C,Tailo R H.Initiation of plasmid pC194 replication and its control in Bacillus subtilis[J]. Mol Gen Genet,1988,210:476-484.

[45] Gryczan T J , Hahn J , Contente S ,et al. Replication and incompatibility properties of plasmid pE194 in Bacillus subtilis[J]. J Bacteriol,1982,152: 722-735.

[46] Aoki T, Noguchi N, Sasatsu M,et al. Complete nucleotide sequence of pTZ12, a chloramphenicol-resistance plasmid of Bacillus subtilis[J]. Gene,1987,51(1):107-111.

[47] Branislav V,Gerard V. Expression of the neutral protease gene from a thermophilic Bacillus sp. BT1 strain in Bacillus subtilis and its natural host: Identification of a functional promoter[J]. J Bacteriol,2000,182:4 104-4 107.

[48] Tauch A, Kassing F, Kalinowski J,et al.The erythromycin resistance gene of the Corynebacterium xerosis R-plasmid pTP10 also carrying chloramphenicol, kanamycin, and tetracycline resistances is capable of transposition in Corynebacterium glutamicum[J]. Plasmid,1995,33: 168-179.

[49] Tauch A, Krieft S, Kalinowski J,et al. The 51,409-bp R-plasmid pTP10 from the multiresistant clinical isolate Corynebacterium striatum M82B is composed of DNA segments initially identified in soil bacteria and in plant, animal, and human pathogens[J]. Mol Gen Genet,2000,263: 1-11.

[50] Tauch A, Pühler A, Kalinowski J,et al. Plasmids in Corynebacterium glutamicum and their molecular classification by comparative genomics[J]. J Biotechnol,2003,4: 27-40.

[51] Biswas I, Jha J K, Fromm N.Shuttle expression plasmids for genetic studies in Streptococcus mutans[J]. Microbiol,2008,154(8):2 275-2 282.

[52] Roland J S, Bernadet R, Iris van S,et al.Complete sequences of four Plasmids of Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 reveal extensive adaptation to the dairy environment[J]. Appl Environ Microbiol,2005,71:8 371- 8 382.

[53] Bron S, Bosma P, van Belkum M,et al. Stability function in the Bacillus subtilis plasmid pTA 1060[J]. Plasmid,1987,18(1):8-15.

[54] Thomas D J, Morgan J A, Whipps J M,et al.Transfer of plasmid pBC16 between Bacillus thuringiensis strains in non-susceptible larvae[J]. FEMS Microbiol Ecol,2002,40: 181-190.

[55] Helmann J D. The extracytoplasmic function (ECF) sigma factors[J]. Adv Microb Physiol,2002 46: 47- 110.

[56] Hook-Barnard I G, Hinton D M.Transcription initiation by mix and match elements: flexibility for polymerase binding to bacterial promoters[J]. Gene Regul Syst Bio,2007,1: 275- 293.

[57] Huerta A M, Collado-Vides J.Sigma 70 promoters in Escherichia coli: specific transcription in dense regions of overlapping promoter-like signals[J]. J Mol Biol,2003,333: 261- 278.

[58] Mutalik V K, Nonaka G, Ades S E,et al. Promoter strength properties of the complete sigma E regulon of Escherichia coli and Salmonella enterica[J]. J Bacteriol,2009,191:7 279-7 287.

[59] Thompson K M, Rhodius V A, Gottesman S.Sigma E regulates and is regulated by a small RNA in Escherichia coli[J]. J Bacteriol,2007,189: 4 243- 4 256.

[60] Stormo G D.DNA binding sites: representation and discovery[J]. Bioinformatics,2000,16: 16- 23.

[61] Chiang C J, Chen P T, Chao Y P.Secreted production of Renilla luciferase in Bacillus subtilis[J]. Biotechnol Prog,2010,26:589-594.

[62] Paccez J D, Luiz W B, Sbrogio-Almeida M E,et al. Stable episomal expression system under control of a stress inducible promoter enhances the immunogenicity of Bacillus subtilis as a vector for antigen delivery[J]. Vaccine,2006,24: 2 935- 2 943.

[63] Xia Y, Chen W, Zhao J, et al. Construction of a new food-grade expression system for Bacillus subtilis based on theta replication plasmids and auxotrophic complementation[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2007,76: 643-650.

[64] Ying Q, Zhang C, Guo F,et al. Secreted expression of a hyperthermophilic α-amylase gene from Thermococcus sp. HJ21 in Bacillus subtilis[J]. J Mol Microbiol Biotechnol,2012,22: 392-398.

[65] Hiroshi I, Tanaka T, Ogura M.The Bacillus subtilis response regulator gene degU is positively regulated by CcpA and by catabolite-repressed synthesis of ClpC[J]. J Bacteriol,2013,195: 193 - 201.

[66] Ludek S, Tomás K, Ivan B. Rapid changes in gene expression: DNA determinants of promoter regulation by the concentration of the transcription initiating NTP in Bacillus subtilis[J]. Nucl Acids Res,2011, 39: 4 598 - 4 611.

[67] Liu S L, Du K. Enhanced expression of an endoglucanase in Bacillus subtilis by using the sucrose-inducible sacB promoter and improved properties of the recombinant enzyme[J]. Protein Expr Purif,2012, 83: 164-168.

[68] Yamamoto H, Serizawa M, Thompson J,et al. Regulation of the glv operon in Bacillus subtilis: YfiA (GlvR) is a positive regulator of the operon that is repressed through CcpA and cre[J]. J Bacteriol,2001,183: 5 110-5 121.