朱丹 陳衛(wèi)國 杜嬋娟 付崗 黃興振 付書婕 趙有林 蔣偉哲

金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl]為蘭科的藥用植物，生長在土壤腐殖質(zhì)較多、光線較弱、相對濕度大的闊葉林中[1]，具有保肝、防癌、抗氧化、抗炎等多種藥理作用[2]。近年來，因其生長環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，野生資源被過度采挖，加之具有繁殖率低、生長緩慢等特點，使得金線蓮野生資源瀕臨滅絕[3]。在野生狀態(tài)下，所有蘭科植物都與真菌共生[4-5]，野生金線蓮亦與內(nèi)生真菌形成菌根共生關(guān)系，篩選促進(jìn)金線蓮生長發(fā)育的益生菌，研究它們的相互作用具有重大的理論意義。本課題組在廣西桂林等地采集野生金線蓮，并從該植物根中分離出多株菌根真菌，研究發(fā)現(xiàn)，這些真菌可以增加植物芽和根的數(shù)量，促進(jìn)金線蓮試管苗的生長。為了進(jìn)一步研究菌根真菌對金線蓮生長發(fā)育的影響，課題組對金線蓮菌根真菌進(jìn)行分離，并采用分子技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對分離物進(jìn)行鑒定，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌根真菌的分離和形態(tài)學(xué)觀察

采集野生金線蓮植株，取其根部用無菌水沖洗干凈，切成0.5～1 cm小段，75%乙醇表面消毒3～5秒，無菌水沖洗凈消毒液后，再用0.1%HgCl2表面消毒6～8分鐘，無菌水沖洗后將根段接種于PDA平皿內(nèi)，25℃恒溫培養(yǎng)，待從根內(nèi)長出真菌菌絲后，挑取尖端菌絲純化培養(yǎng)。將純化的6株真菌菌株(編號分別為2、5、6、A12、A46、A55)在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂17 g、水1000 ml)平板上于28℃恒溫下黑暗培養(yǎng)，每天觀察菌落的形態(tài)特征和顏色變化，并于顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、鑒定。

1.2 分子生物學(xué)特征測定

1.2.1 基因組DNA的提取 收集PDA平板上的菌絲體，采用SDS-CTAB法分別提取各菌株的基因組DNA。具體操作如下：取0.1 g新鮮菌絲體，在液氮中研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)入1.5 ml的離心管中，加入750 μl提取緩沖液，置65℃水浴30分鐘；室溫下12 000 r/min離心10分鐘，取上清液，加入1/10的3 mol/L KAc，冰浴20分鐘；室溫下12 000 r/min離心10分鐘，取上清液，加入等體積的異丙醇，冰浴20分鐘；12 000 r/min離心10～20分鐘；棄上清，加入400 μl ddH2O及5 μl RNAase，37℃水浴1小時；加入等體積的酚/氯仿(1:1)顛倒混勻40次；室溫下12 000 r/min離心10分鐘，取上清液，再加入 1/10 KAc，冰浴20分鐘(重復(fù)1次)；用2倍體積無水乙醇沉淀20分鐘，12 000 r/min離心10分鐘；用-20℃ 預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀3次，室溫干燥5～10分鐘后加入TE溶液溶解沉淀。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及純化測序 以各菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增ITS區(qū)的保守區(qū)段，選用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μl，其中含10×PCR buffer 2 μl，dNTP0.5 μl，ITS1 0.6 μl，ITS4 0.6 μl，無菌超純水15.1 μl，模板DNA 1 μl，Taq酶0.2 μl。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性55秒，56℃退火50秒，72℃延伸l分鐘，32個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker DL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，穩(wěn)壓120 V下電泳30分鐘。電泳結(jié)果用紫外檢測儀觀察，置于圖像處理儀中處理并保存。目的片段用UNIQ-10柱式膠回收試劑盒回收純化，純化樣品進(jìn)行基因序列測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 序列經(jīng)BioEdit軟件分析和手工校正后，用NCBI的BLAST程序?qū)y得序列與GenBank中已有菌株的ITS序列進(jìn)行同源性比對，采用MAGA (3.1)軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征觀察結(jié)果

各菌株在PDA培養(yǎng)基上生長，菌落初期灰白色，漸變?yōu)榈稚秸?，生長速度快，氣生菌絲繁茂，28℃下培養(yǎng)3天后，直徑可達(dá)80 mm，7天即可產(chǎn)生菌核(見圖1)。菌絲初期灰白色，漸變?yōu)榈稚?，直?2～14 μm；菌絲分支處有縊縮，近分支處形成隔膜。菌核由菌絲糾集生成，褐色，內(nèi)外顏色一致，表面粗糙，大小均一，可聚集聯(lián)結(jié)；無性態(tài)不產(chǎn)生孢子(見圖2)。

A 金錢蓮菌根真菌早期菌落

B 金錢蓮菌根真菌后期菌落圖1 金錢蓮根真菌菌落特征

A 幼嫩菌絲

B 老熟菌絲

C 菌核圖2 金線蓮菌根真菌菌株的顯微形態(tài)

2.2 ITS序列分析及種類鑒定

各菌株的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，回收后，通過序列測定得到分別為668bps～686bps的各菌株的ITS堿基序列，見表1。

表1 菌株rDNA ITS區(qū)序列測定結(jié)果

2.3 基于ITS序列的同源性比較

在GenBank中與已有的相關(guān)菌株的ITS序列進(jìn)行同源性比較，用MAGA(3.1)軟件將以上菌株與來自GenBank的27株真菌一起構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。發(fā)育樹的構(gòu)建，以親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的低等真菌(Pythiumsp.)為外群，見圖3。結(jié)果顯示A12菌株與5號菌株出現(xiàn)在同一最小分支，說明這兩菌株的親緣關(guān)系最近；2號菌株與6號菌株出現(xiàn)在同一最小分支，說明這兩菌株的親緣關(guān)系最近；A46菌株和A55菌株與前述4株真菌的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，但仍同處于同一較小分支內(nèi)。所得菌株均與Thanatephorussp.及Rhizoctoniasp.具有較高的同源性。結(jié)合各菌株的形態(tài)特征和ITS區(qū)域基因序列特征，將A12菌株、5號菌株、2號菌株、6號菌株、A46菌株和A55菌株鑒定為絲核菌(Rhizoctoniasp.)，其有性態(tài)為Thanatephorussp.或Ceratobasidiumsp.。

3 討論

絲核菌(Rhizoctoniasp.)屬的有些成員是農(nóng)作物的病原菌，如立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)能引起棉花的立枯病[6]和水稻、玉米的紋枯病[7]。也有報道某些種類的絲核菌可與蘭科植物共生，利于植株的生長[8]。本研究獲得的6株絲核菌從金線蓮根部分離，可促進(jìn)金線蓮的生長發(fā)育，對其他蘭科植物是否具有促生作用，還有待進(jìn)一步研究。

圖3 基于ITS序列同源性的各菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

[1] 譚小明,郭順星,周雅琴,等.廣西金線蓮內(nèi)生真菌的分離及抗菌活性研究[J].中國藥學(xué)雜志,2010,45(3):178-181.

[2] Huang L, Chen T, Ye Z, et al. Use of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-ion trap mass spectrometry for identification of oleanolic acid and ursolic acid in Anoectochilus roxburghii (wall.) Lindl[J]. J Mass Spectrom, 2007, 42(7): 910-917.

[3] 王雅俊,孟志霞,于雪梅,等.促進(jìn)福建金線蓮生長發(fā)育的內(nèi)生真菌篩選研究[J].中國藥學(xué)雜志,2009,44(13):976-979.

[4] 郭順星,陳曉梅,于雪梅.金線蓮菌根真菌的分離及其生物活性研究[J].中國藥學(xué)雜志,2000,35(7):443-445.

[5] Látalová K and Balá M. Carbon nutrition of mature green orchid Serapias strictiflora and its mycorrhizal fungus Epulorhiza sp[J]. Biol Plant,2010, 54: 97-104.

[6] 王偉娟,鹿秀云,李寶慶,等.河北省棉花立枯絲核菌菌絲融合群及其致病性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報,2010,25(增刊):274-278.

[7] 馮典興,鄭愛萍,王世全,等.四川省不同寄主立枯絲核菌的遺傳分化和致病力研究[J].植物病理學(xué)報,2005,35(6):520-525.

[8] 伍建榕,韓素芬,朱有勇,等.春蘭與絲核菌共生菌根及結(jié)構(gòu)研究[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,29(4):105-108.