魏巍 劉葵葵 韓捷

Tregs細(xì)胞CCR4、CCR6表達(dá)異常在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病時的意義

魏巍 劉葵葵 韓捷

目的 探討Tregs細(xì)胞CCR4、CCR6受體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者發(fā)病時的意義。方法選擇45例活動期RA患者（RA組）及30例健康體檢者（對照組），從外周血分離單個核細(xì)胞（PBMC），采用流式細(xì)胞分析法檢測RA患者外周血中CD4+Foxp3+細(xì)胞（Tregs）占比及其該類細(xì)胞上CCR4、CCR6的表達(dá)水平，并對Tregs上CCR4、CCR6水平與RA臨床活動指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果與對照組比較，RA活動期患者外周血Tregs細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RA活動期患者外周血Tregs細(xì)胞表面趨化因子受體CCR4、CCR6表達(dá)水平與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RA活動期患者外周血Tregs細(xì)胞CCR4、CCR6表達(dá)水平與DAS28評分呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論RA患者外周血中Tregs細(xì)胞上趨化因子受體CCR4、CCR6表達(dá)增加，可能是Tregs細(xì)胞獲得定向遷徙至病變關(guān)節(jié)能力的表現(xiàn)，也是機體炎癥反應(yīng)時反饋性調(diào)節(jié)的一種現(xiàn)象。

Tregs細(xì)胞 CCR4 CCR6 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

【 Abstract】 ObjectiveTo explore the role of CCR4 andCCR6 abnormal expression on Tregs in RA and the mechanism that may be involved.MethodsPeripheral blood mononuclear cells (PBMC)were isolated from blood in RA patients.Immunofluorescence staining and flow cytometry assay were used to detect the expression of CCR4,CCR6 on Tregs surface.The correlation analysis between expression level of CCR4 and CCR6 on Tregs and the clinical activity parameters was performed.ResultsThe expression of Tregs in peripheral blood of RA patients was lower than healthy control(P＜0.05).The expression levels of chemokine receptor of CCR4,CCR6 on Tregs cell in peripheral blood of RA patients in active phase were higher than healthy control(P＜0.05).The expression levels of chemokine receptor CCR4,CCR6 on Tregs cell in RA patients who were in active phase was positively correlated with the level of the DAS28 score(P＜0.05)．ConclusionThe increased expression of CCR4,CCR6 on Tregs surface in rheumatoid arthritis patients not only means Tregs cell obtain the capability to directional migrate to joint,but also represents feedback regulation in the body's inflammatory response.

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性、進(jìn)行性及侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制一般認(rèn)為是因大量CD4+T細(xì)胞對自身抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞因子的釋放，形成炎性損傷。Tregs細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞中重要的亞群，具有趨向功能。趨化因子（chemokines）是一類具有趨化炎性細(xì)胞定向游走作用的細(xì)胞因子，趨化因子和其相應(yīng)的受體結(jié)合，在淋巴細(xì)胞歸巢、遷移，T淋巴細(xì)胞激活、血細(xì)胞的生成等方面發(fā)揮著重要作用[1]，此外，趨化因子受體的表達(dá)也與血管炎的發(fā)生有關(guān)。臨床上已證實Tregs細(xì)胞有部分趨化因子受體表達(dá)，主要為CCR4、CCR6。目前Tregs細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)與RA發(fā)病關(guān)系研究報道極少，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測RA外周血中Tregs細(xì)胞水平，同時測定Tregs細(xì)胞表面CCR4、CCR6受體表達(dá)情況，觀察上述指標(biāo)與RA疾病活動和病情發(fā)展等各項臨床指標(biāo)的關(guān)系，探索RA患者Tregs細(xì)胞變化與趨化因子受體表達(dá)的關(guān)系，分析它們在RA的發(fā)病機制中的臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2009-11—2010-10在余姚市人民醫(yī)院門診就診的45例活動期RA患者，其中男15例，女30例，年齡28～64歲，平均（46.32±13.31）歲；平均病程（70.48±50.12）個月。所有患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，病情均處于活動期，并排除腫瘤和其他自身免疫性疾病，采血前2周無任何感染性疾病史。選取同期余姚市人民醫(yī)院體檢中心健康體檢者30例作為對照組，其中男11例，女19例，年齡22～66歲，平均（42.12±10.15）歲。兩組患者性別、年齡的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得余姚市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 淋巴細(xì)胞分離液購于上海華精生物高科技有限公司，RMPI1640購于美國Gbico公司，F(xiàn)ITC-Foxp3、Percp-Cy5.5-anti-humanCD4、PE-anti-human-CCR4、PE-anti-human-CCR6、Fixation/Permeabilization Diluent、Fixation/Permeabilization Concentrate、Fixation/PermeabilizationWashing Buffer購于美國Ebioscience公司。離心機（型號CR22GIII）購于日本Hitachi公司，流式細(xì)胞儀（型號FACScan）購于美國Becton Dickinson公司。

1.3 臨床和實驗室檢查 患者類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動性評分（DAS28評分）＞3.2分為RA活動期判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。DAS28評分計算方法：（1）觸痛關(guān)節(jié)數(shù)：檢查雙側(cè)近端指間關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)計28個關(guān)節(jié)觸痛數(shù)以及被動活動時關(guān)節(jié)觸痛數(shù)（T28）；（2）腫脹關(guān)節(jié)數(shù)：檢查上述28個關(guān)節(jié)腫脹與否，得出關(guān)節(jié)腫脹數(shù)（SW28）；（3）根據(jù)以下公式利用血沉（ESR）數(shù)值計算出DAS28。DAS28=0.54×sqrt（T28）+0.065×（SW28）+0.33×ln（ESR）+0.0072×GH。同時檢測兩組疾病活動相關(guān)指標(biāo)ESR、C反應(yīng)蛋白（CRP）、DAS28評分及預(yù)后相關(guān)指標(biāo)類風(fēng)濕因子（RF）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測 提取外周血單個核細(xì)胞（PBMC），采用含100ml/L胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，標(biāo)記2個流式管，分別加入50μl細(xì)胞懸液。每管加入5μl的Percp-Cy5.5-anti-humanCD4，避光孵育30min。使用冷的PBS1ml輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1 200r/min離心5min，洗滌2次后棄去上層液體。再分別向兩管分別加入PE-鼠抗人單克隆抗體CCR4、PE-鼠抗人單克隆抗體CCR6 5μl，混勻，室溫避光孵育40min。用冷的PBS緩沖液1ml輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1 200r/min離心5min，洗滌2次后棄去上層液。每管加入1ml eBioscience的固定/穿透緩沖液（按照1∶3比例配好），震蕩混勻，室溫避光放置60min。加入PBS緩沖液（含10%FCS）2ml，1 200r/min離心5min，洗滌細(xì)胞1次。再配制成每管50μl重懸細(xì)胞，每管加入FITC-鼠抗人 Foxp3單克隆抗體 20μl，混勻，4℃下避光孵育40min。用1ml穿透緩沖液洗滌細(xì)胞，1 200r/min離心5min，洗滌細(xì)胞2次。離心后棄去上層液體。洗滌重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測，并采用BDFACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析。設(shè)陰性對照，小鼠抗人單克隆抗體-FITC、小鼠單克隆抗體-Percp-cy5.5、小鼠單克隆抗體-PE作為同型對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，外周血Tregs細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平與臨床活動指標(biāo)的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組Tregs細(xì)胞占比的比較 RA活動期患者具有抑制作用的Tregs細(xì)胞亞群占比為（1.21±0.43）%，比對照組（3.50±0.98）%低，兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 兩組外周血Tregs細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平的比較 見表1。由表1可見，RA組外周血Tregs細(xì)胞上趨化因子受體CCR4、CCR6表達(dá)水平較對照組高，兩組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 兩組外周血Tregs細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平的比較（%）

2.3 RA患者外周血Tregs細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平與臨床活動指標(biāo)的相關(guān)性 見表2。

表2 RA患者外周血Tregs細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)水平與臨床活動指標(biāo)的相關(guān)性

由表2可見，Tregs細(xì)胞趨化因子受體CCR4、CCR6表達(dá)水平與DAS28評分呈正相關(guān)性（P＜0.05），與ESR、CRP、RF無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

RA是一種主要累及關(guān)節(jié)滑膜的自身免疫性疾病，病理改變是慢性滑膜炎、血管翳形成和大量炎細(xì)胞浸潤等。滑膜中聚集的炎細(xì)胞可產(chǎn)生和釋放大量炎性介質(zhì)，破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和畸形。RA分布廣，發(fā)病率高，發(fā)病機制尚不十分清楚，T細(xì)胞功能紊亂是其發(fā)病的重要因素之一[4]。

機體CD4+T細(xì)胞亞群間相互平衡和網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用是機體維持正常的免疫功能狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)。目前研究認(rèn)為，除Th1/Th2細(xì)胞數(shù)量失衡外，Th17/Tregs細(xì)胞的數(shù)量失衡也是RA發(fā)病重要機制之一。CD4+T細(xì)胞中Tregs細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，具有趨向功能。多項研究發(fā)現(xiàn)銀屑病性關(guān)節(jié)炎、幼年關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病患者的外周血中Tregs細(xì)胞數(shù)量均較正常明顯減少[5-6]。關(guān)于Tregs在RA發(fā)病中的作用，最早源自于對RA動物模型-膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis,CIA）的研究。該研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CIA小鼠發(fā)病早期T細(xì)胞、B細(xì)胞尚未充分激活時，單獨注射純化的Tregs細(xì)胞能明顯減輕關(guān)節(jié)炎癥，可見Tregs細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，RA中Tregs細(xì)胞數(shù)量下降，尤其在疾病的活動期，Tregs細(xì)胞數(shù)量明顯下降，可能是RA自身免疫反應(yīng)亢進(jìn)不能控制的原因之一[7]。本研究發(fā)現(xiàn)RA患者CD4+T細(xì)胞中具有抑制炎性免疫反應(yīng)的Tregs細(xì)胞占比較對照組減少，提示RA患者體內(nèi)存在細(xì)胞免疫平衡紊亂。

近十幾年來，人們一直致力于趨化因子及其受體在RA發(fā)病機制中的作用研究，發(fā)現(xiàn)趨化因子及其受體在淋巴細(xì)胞向RA炎癥關(guān)節(jié)遷移的過程中發(fā)揮重要作用，其中CCR4、CCR6在RA外周血記憶淋巴細(xì)胞上的表達(dá)明顯升高，可能在淋巴細(xì)胞向RA關(guān)節(jié)歸巢的過程中尤為重要[8]。近年來發(fā)現(xiàn)，CCR4、CCR6亦可表達(dá)于Th17和Tregs細(xì)胞[9]，提示CCR4、CCR6可能在效應(yīng)T細(xì)胞/調(diào)節(jié)T細(xì)胞失衡介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究中 RA患者外周血 Tregs細(xì)胞趨化因子受體CCR4、CCR6表達(dá)是增加的，提示在RA的發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)亢進(jìn)，趨化因子受體CCR4、CCR6作為介導(dǎo)Tregs細(xì)胞定向遷徙至病變關(guān)節(jié)過程可能發(fā)揮重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)RA活動期患者外周血中Tregs細(xì)胞數(shù)量減少，提示RA患者Tregs細(xì)胞減少可能與自身免疫反應(yīng)平衡失調(diào)、炎癥反應(yīng)不能控制有關(guān)，而其Tregs細(xì)胞上趨化因子受體CCR4、CCR6表達(dá)增加,其原因可能與RA時關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)亢進(jìn)，受機體反饋調(diào)節(jié)，Tregs細(xì)胞上表面趨化因子受體反應(yīng)性增多有關(guān)，從而促進(jìn)其向炎癥部位移動，發(fā)揮免疫抑制作用。

本研究顯示，在RA活動期Tregs細(xì)胞上CCR4、CCR6水平明顯增高，與病情活動DAS28評分有明顯的相關(guān)性，RA活動期患者Tregs細(xì)胞上CCR4、CCR6表達(dá)的異常與疾病的進(jìn)展有相關(guān)性。

綜上所述，RA患者存在外周血Tregs細(xì)胞數(shù)量減少，這可能是導(dǎo)致RA患者與自身免疫反應(yīng)平衡失調(diào)有關(guān)，而其Tregs細(xì)胞上趨化因子受體CCR4、CCR6表達(dá)增加,其原因可能與RA時關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)亢進(jìn)，Tregs細(xì)胞上表面趨化因子受體反應(yīng)性增多有關(guān)，從而促進(jìn)其向炎癥部位移動。CCR4、CCR6的表達(dá)增加可能是Tregs細(xì)胞獲得定向遷徙至病變關(guān)節(jié)能力的表現(xiàn)，也是機體炎癥反應(yīng)時反饋性調(diào)節(jié)的一種現(xiàn)象。筆者通過了解Tregs細(xì)胞上趨化途徑異常在RA中的臨床意義，為進(jìn)一步尋找RA靶向治療及聯(lián)合治療措施提供新的思路。

[1] 曹雪濤.免疫學(xué)前沿進(jìn)展[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:302-306.

[2] Arnett F C,Edworthy S M,Bloch D A,et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification ofrheumatoidarthritis[J].ArthritisRheum,1988,31(6):315-324.

[3] Vander C B,Van L S,Wyns B,et al.DAS 28 reflects best the physician's clinical judgement of response to infliximab therapy in rheumatoid arthritis patients:validation of the DAS28 score in patients under infliximab treatment[J].Arthritis Res Ther,2005,7 (5):1063-1071.

[4] Bluestone J A,Abbas A K.Natural versus adaptive regulatory T cells[J].Net Rev Immunol,2003,3(3):253-257.

[5]Nasonov E L,Bykovskaia S N.The role of regulatory T-cells in autoimmune rheumatic diseases[J].Vestn Ross Akad Med Nauk, 2006,9(10):74-82.

[6]Kleer I M,Wedderburn L R,TaamsL S,et al.CD4+CD25bright regulatory T cells actively regulate inflammation in the joints of patients with the remitting form of juvenile idiopathic arthritis[J]. Immunol,2004,172(10):6435-6443.

[7] 牛倩,黃卓春,蔡蓓.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血Th17/Tregs細(xì)胞比率失衡的研究[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010,26(3):267-270.

[8]Lawson C A,Brown A K,Bejarano V,et al.Early rheumatoid arthritis is associated with a deficit in the CD4+CD25+regulatory T cells population in peripheral blood[J].Rheumatology,2006,45(9): 1210-1217.

[9] Lim H W,Lee J,Hillsamer P,et al.Human Th17cells share major trafficking receptors with both polarized effector T cells and FOXP3+regulatory T cells[J].Immunol,2008,180(1):122-129.

The pathogenic significance of increased CCR4,CCR6 expression on Tregs cells in rheumatoid arthritis

Tregs CCR4 CCR6 Rheumatoid Arthritis

2012-07-03）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

余姚市科技計劃項目（2009Y06）

315400 余姚市人民醫(yī)院風(fēng)濕科（魏巍、劉葵葵）；上海東方醫(yī)院風(fēng)濕科（韓捷）

魏巍，E-mailjiayi435@126.com