余江流 凌志強 韓靜 呂萍 余齊鳴 鄭智國 趙挺 王建軍

胃癌組織中TIMP-3基因甲基化水平及臨床意義研究

余江流 凌志強 韓靜 呂萍 余齊鳴 鄭智國 趙挺 王建軍

目的 探討胃癌患者癌組織中組織金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）基因啟動子CpG島甲基化與胃癌侵襲轉移能力及預后的相關性。 方法 運用甲基化特異性實時熒光定量聚合酶鏈反應（qMSP）技術檢測92例胃癌患者癌組織、癌旁組織和40例正常人胃組織、48例胃炎患者胃組織中TIMP-3基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài),分析TIMP-3基因異常甲基化與胃癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。 結果 92例胃癌患者癌組織中,58例（63.0%）檢測到TIMP-3基因甲基化,配對的癌旁組織中只有4例（4.4%）存在TIMP-3基因甲基化，正常人胃組織和胃炎組織中均沒有TIMP-3基因甲基化。TIMP-3基因甲基化與腫瘤大小、生長類型、分化程度、靜脈侵犯、浸潤深度、淋巴結轉移和臨床分期間均存在相關性（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、Hp感染狀況以及腫瘤著生部位等無關（均P＞0.05）。生存分析表明TIMP-3基因非甲基化胃癌患者具有獨立的生存優(yōu)勢（P＜0.01）。 結論 胃癌患者TIMP-3基因甲基化增強腫瘤的侵襲能力，甲基化水平和腫瘤惡性程度正相關，TIMP-3基因高甲基化提示胃癌患者不良預后。

胃腫瘤 TIMP-3基因 甲基化 臨床意義

Gastric neoplasms Tissue inhibitor of metalloproteinase 3 gene Methylation Clinical significance

胃癌是世界高發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率和致死率均處于各大惡性腫瘤前列，并且一直處于上升趨勢[1-2]。最近研究表明以DNA甲基化為主要調控方式的表觀遺傳調控在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3]?；|金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-3）基因是位于22號染色體q13.1位置的抑癌基因，其表達產物TIMP-3蛋白是基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）抑制劑，具有抑制上皮細胞轉移、抑制腫瘤血管生成、抑制細胞增殖及促進細胞分化和凋亡的功能[4-8]。最新有研究報道，在各種腫瘤中均存在TIMP-3基因甲基化失活現象，可影響患者的治療效果和預后[9-12]。本研究采用甲基化特異性實時熒光定量PCR（quantitative methylation-specific real-time PCR，real-time MSP）技術對胃癌組織和胃炎以及正常胃組織TIMP-3基因啟動子CpG島甲基化水平進行檢測,并探討其臨床意義及在預后評價中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 組織樣本收集于浙江省腫瘤醫(yī)院、浙江省人民醫(yī)院和杭州市淳安縣第一人民醫(yī)院，其中包括2008-1—2009-12病理確診的92例原發(fā)性胃腺癌患者癌組織（男53例，女39例，平均年齡53.8周歲）、癌旁組織和年齡性別匹配的正常胃黏膜組織（正常志愿者胃鏡取得）40例（男24例，女16例；平均年齡51.5周歲）、胃炎組織48例（男30例，女18例，平均年齡64.2周歲）。病例均經術前內鏡活檢病理診斷,術后組織標本均經石蠟切片病理確診。所有患者術前均未行放療和化療，臨床病理資料見表1。本研究經浙江省腫瘤醫(yī)院、浙江省人民醫(yī)院和杭州市淳安縣第一人民醫(yī)院倫理委員會批準同意，患者均簽署知情同意書。

表1 胃癌患者臨床病理特征與TIMP-3基因甲基化關系（例）

全部患者由本研究組隨訪負責人專門跟蹤隨訪,具有完整的隨訪資料,均自手術日起計生存和隨訪時間,至患者死亡或隨訪截止到2011-06。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 將所取組織切成5μm的切片，置于載玻片上37℃干燥過夜。經脫石蠟處理后，HE染色，用27G針挑選約5 000個腫瘤細胞核，然后在42℃下用40μl 200μg/ml的蛋白酶K（Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO）處理72h。用苯酚、氯仿、異戊醇和乙醇沉淀法提純DNA，用紫外分光光度計（Nano Drop，ND-1 000）檢測A260/A280值評價DNA質量。

1.2.2 亞硫酸氫鹽處理 DNA樣本按EpiTect Bisulfite（Qiagen公司）使用說明書操作。10 μg基因組DNA內加入5μl濃度為3mol/L的NaOH裂解液，37℃變性20min后加入2mol/L亞硫酸氫鈉（pH5.0）520μl和0.2 mol/L的氫醌30μl，50℃水浴16～18h，于1ml DNA純化樹脂中加入DNA樣品及8%異丙醇2ml濾析，3mol/L的醋酸鈉與100%乙醇沉淀，離心棄上清液，自然干燥，加20μl TE溶液溶解,采用全基因組擴增技術對亞硫酸氫鹽修飾DNA進行擴增，-20℃保存。

1.2.3 qMSP分析 甲基化和非甲基化的TIMP-3基因引物由Invitrogen公司合成，序列見表2。在ABI 7 500 PCR儀（ABI system,美國）上對亞硫酸氫鈉法修飾的DNA模版進行qMSP分析,按SYBR Premix Taq ExTaq Kit（TaKaRa公司）說明書進行。各樣品分別使用甲基化、非甲基化引物進行定量分析,用體外經SssI甲基轉移酶處理的人類基因組DNA（NEB公司）作為陽性對照、未處理的正常人外周血DNA作為陰性對照,蒸餾水代替模板作為空白對照。根據所測CT值通過標準曲線計算在各樣品DNA中甲基化的拷貝數和非甲基化拷貝數。甲基化百分率計算公式如下：甲基化百分率M%=甲基化DNA拷貝數/（靶基因總拷貝數）×100%（甲基化DNA拷貝數和非甲基化DNA拷貝數的總和記作靶基因總拷貝數）。按甲基化水平分為0～4共5個等級，M%＜20.0%為0分，評為0級，20.0%≤M%＜40.0%為1分，評為1級，40.0%≤M%＜60.0%為2分，評為2級，60.0%≤M%＜80.0%為3分，評為3級，M%≥80.0%為4分，評為4級。PCR反應結束后由熔解曲線及擴增曲線判定擴增結果。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件,各組間率的差異比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,單因素生存分析以及生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法，Log-Rank檢驗進行生存比較。用Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析,顯著性檢驗采用Wald檢驗。

表2 TIMP-3基因甲基化和非甲基化引物序列

2 結果

2.1 胃癌患者癌組織及癌旁組織、正常人和胃炎患者胃組織TIMP-3基因甲基化水平 40例正常胃黏膜組織和48例胃炎組織均未檢測到TIMP-3基因啟動子CpG島甲基化。92例胃癌患者癌組織中，TIMP-3基因啟動子CpG島異常甲基化占63.0%（58/92），未甲基化37.0%（34/92）。癌旁組織中，只有4.4%（4/92）的患者檢測到TIMP-3基因啟動子CpG島異常甲基化，并且甲基化水平均為1級，即甲基化率＜40%，如圖1。胃癌組織TIMP-3基因啟動子CpG島甲基化比例顯著高于癌旁組織（63.0%vs4.4%，P＜0.01）。

圖1 胃癌患者癌組織（A）和癌旁組織（B）TIMP-3基因甲基化水平

2.2 胃癌患者TIMP-3基因甲基化與臨床病理特征的關系 胃癌患者的TIMP-3甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關系分析表明，腫瘤＞5cm的甲基化水平高于腫瘤＜5cm的；腫瘤浸潤型生長的甲基化水平高于膨脹性生長；低分化腫瘤的甲基化水平高于高中分化；淋巴管侵犯陽性、靜脈侵犯陽性、淋巴結有轉移的患者甲基化水平高于陰性患者；T3、T4期患者甲基化水平高于T1、T2期患者；臨床分期Ⅲ/Ⅳ期患者甲基化水平高于Ⅰ/Ⅱ期（均P＜0.05）。而TIMP-3基因甲基化水平與患者年齡、性別、是否Hp感染、是否存在遠處轉移和腫瘤位置間沒有相關性（P＞0.05），見表1。

2.3 TIMP-3基因高甲基化預示胃癌患者不良預后Kaplan-Meier單因素分析結果表明TIMP-3基因甲基化影響胃癌患者的預后。根據甲基化分數將胃癌患者分為低甲基化組（0分）、中甲基化組（1～3分）和高甲基化組（4分），低甲基化組胃癌患者在最長隨訪42個月內所有病例均未出現復發(fā)，而中甲基化組和高甲基化組分別在隨訪19個月和15個月時出現首例進展病例。TIMP-3基因甲基化患者術后生存狀況較非甲基化患者差,見圖2。Cox回歸模型分析表明TIMP-3基因甲基化是胃癌患者預后的獨立影響因子（P=0.01，RR=2.203，95%CI:1.21～4.01）。

圖2 胃癌患者TIMP-3基因甲基化與無進展生存期的關系

3 討論

TIMP-3蛋白是內源性的基質金屬蛋白酶抑制因子，參與正常細胞的生物學行為，在腫瘤的發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用，有研究報道[13-16]在胃癌、乳腺癌和食管癌等腫瘤中TIMP-3基因甲基化導致表達下調，從而影響患者的治療敏感性和預后。本研究發(fā)現63.0%的胃癌患者癌組織存在不同程度的TIMP-3基因啟動子CpG島甲基化，只有4.4%的配對癌旁組織中檢測到TIMP-3基因甲基化。而在正常胃黏膜和胃炎患者組織中均未檢測到，這表明TIMP-3基因的甲基化和胃癌有明顯的相關性。胃癌患者癌組織TIMP-3甲基化程度顯著高于癌旁組織，因此組織TIMP-3基因的檢測可以用于術前評價，作為手術切除范圍的一個參考指標。

TIMP-3基因甲基化水平與患者臨床病理特征關系的分析表明瘤體越大，分化程度越低及分期越晚的患者癌組織TIMP-3基因甲基化概率越大，這與Cruz-Munoz等[10]研究結果一致。從腫瘤生長類型來看，浸潤型生長的腫瘤TINP-3基因甲基化水平明顯高于膨脹型。大量研究報道[17-20]TIMP-3能夠影響細胞的侵襲能力，而TIMP-3基因甲基化提高了食管癌、肺癌以及乳腺癌等腫瘤細胞的侵襲能力。本研究表明浸潤深度越深，存在靜脈侵犯或（和）淋巴管侵犯及淋巴結轉移的患者癌組織TIMP-3基因甲基化程度較高。而在是否存在遠處轉移的患者間沒有觀察到TIMP-3基因甲基化水平的差異，可能是因為樣本量較小，有待增加樣本量進一步研究。與Smith等[16]在食管癌中的研究結果一樣，本研究提示胃癌中TIMP-3基因甲基化水平不受患者年齡、性別及部位影響，胃體、胃竇和賁門腫瘤均存在較高水平的TIMP-3基因甲基化。此外，Hp感染也不會影響TIMP-3基因的甲基化狀態(tài)。

本研究進一步分析了TIMP-3基因甲基化對胃癌患者預后生存的影響，結果表明癌組織TIMP-3基因甲基化是胃癌患者預后的獨立影響因子。隨著TIMP-3基因甲基化水平的升高，胃癌患者術后無進展生存時間顯著下降，這與Gu等[21]研究結果相一致，TIMP-3基因甲基化在其他腫瘤中同樣顯著降低患者的生存時間。Mohammad等[22]研究報道TIMP-3甲基化與膀胱癌患者分期和腫瘤進展相關，顯著降低術后生存時間；Darnton等[18]報道食管癌中甲基化引起的TIMP-3基因表達下調提示不良預后。

總之，TIMP-3基因甲基化是胃癌中的高頻事件。TIMP-3基因甲基化程度隨胃癌進展逐漸增加，導致TIMP-3表達下調，增強了腫瘤細胞的侵襲能力，從而影響患者的治療效果和預后。對胃癌組織TIMP-3基因啟動子CpG島甲基化水平的檢測可以應用于腫瘤的分期分型以及惡性程度評估，TIMP-3基因甲基化水平可以作為胃癌預后評價因子。

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[2]Jemal A,Bray F,Center M M,et al.Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[3]Hou L,Wang H,Sartori S,et al.Blood leukocyte DNA hypomethylation and gastric cancer risk in a high-risk Polish population[J].Int J Cancer,2010,127(8):1866-1874.

[4]Janssen A,Hoellenriegel J,Fogarasi M,et al.Abnormal vessel formation in the choroid of mice lacking tissue inhibitor of metalloprotease-3[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(7):2812-2822.

[5]Zerrouqi A,Pyrzynska B,Febbraio M,et al.P14ARF inhibits human glioblastoma-induced angiogenesis by upregulating the expression of TIMP3[J].Clin Invest,2012,122(4):1283-1295.

[6]Lee J K,Shin J H,Suh J,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases-3(TIMP-3)expression is increased during serum deprivation-induced neuronal apoptosis in vitro and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis:a potential modulator of Fas-mediated apoptosis[J].Neurobiol Dis,2008,30(2): 174-185.

[7]Yang Y,Jalal F Y,Thompson J F,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 mediates the death of immature oligodendrocytes via TNF-α/TACE in focal cerebral ischemia in mice[J].J Neuroinflammation,2011,8:108.

[8]Bernot D,Barruet E,Poggi M,et al.Down-regulation of tissue inhibitor of metalloproteinase-3(TIMP-3)expression is necessary for adipocyte differentiation[J].J Biol Chem,2010,285(9): 6508-6514.

[9]Mylona E,Magkou C,Giannopoulou I,et al.Expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases(TIMP)-3 protein in invasive breast carcinoma:relation to tumor phenotype and clinical outcome[J].Breast Cancer Res,2006,8(5):R57.

[10]Cruz-Mu oz W,Kim I,Khokha R.TIMP-3 deficiency in the host, but not in the tumor,enhances tumor growth and angiogenesis [J].Oncogene,2006,25(4):650-655.

[11]Carvalho A L,Henrique R,Jeronimo C,et al.Detection of promoter hypermethylation in salivary rinses as a biomarker for head and neck squamous cell carcinoma surveillance[J].Clin Cancer Res,2011,17(14):4782-4789.

[12]Liu B L,Cheng J X,Zhang W,et al.Quantitative detection of multiple gene promoter hypermethylation in tumortissue, serum,and cerebrospinal fluid predicts prognosis of malignant gliomas[J].Neuro Oncol,2010,12(6):540-548.

[13]Peterson N B,Beeghly-Fadiel A,Gao Y T,et al.Polymorphisms in tissue inhibitors of metalloproteinases-2 and-3 and breast cancer susceptibility and survival[J].Int J Cancer,2009,125 (4):844-850.

[14]R hrs S,Dirks W G,Meyer C,et al.Hypomethylation and expression of BEX2,IGSF4 and TIMP3 indicative of MLL translocations in acute myeloid leukemia[J].Mol Cancer,2009,8:86.

[15]Waki T,Tamura G,Sato M,et al.Promoter methylation status of DAP-kinase and RUNX3 genes in neoplastic and non-neo-plastic gastric epithelia[J].Cancer Sci,2003,94(4):360-364.

[16]Smith E,De Young N J,Tian Z Q,et al.Methylation of TIMP3 in esophageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol,2008,14(2):203-210.

[17]Castro M,Grau L,Puerta P,et al.Multiplexed methylation profiles of tumor suppressor genes and clinical outcome in lung cancer[J].J Transl Med,2010,8:86.

[18]Darnton S J,Hardie L J,Muc R S,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase-3(TIMP-3)gene is methylated in the development of esophageal adenocarcinoma:loss of expression correlates with poor prognosis[J].Int J Cancer,2005,115(3): 351-358.

[19]Johnson J L,Sala-Newby G B,Ismail Y,et al.Low tissue inhibitor of metalloproteinases 3 and high matrix metalloproteinase 14 levels defines a subpopulation of highly invasive foam-cell macrophages[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008,28(9):1647-1653.

[20]Song B,Wang C,Liu J,et al.MicroRNA-21 regulates breast cancer invasion partly by targeting tissue inhibitor of metalloproteinase 3 expression[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29: 29.

[21]Gu P,Xing X,T nzer M,et al.Frequent loss of TIMP-3 expression in progression of esophageal and gastric adenocarcinomas[J].Neoplasia,2008,10(6):563-572.

[22]Hoque M O,Begum S,Brait M,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 promoter methylation is an independent prognostic factor for bladder cancer[J].J Urol,2008,179(2):743-747.

2012-08-20）

（本文編輯：胥昀）

浙江省科技計劃資助項目（2009C33143）；2011年省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才計劃項目（2011RCA009）

325035 溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院生命科學學院（余江流、凌志強、呂萍、韓靜，余江流系碩士研究生，現在浙江省腫瘤醫(yī)院實習，凌志強系溫州醫(yī)學院碩士生導師）；浙江省腫瘤研究所（凌志強、鄭智國），浙江省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科（余齊鳴）；浙江省人民醫(yī)院普外科（趙挺）；杭州市淳安縣第一人民醫(yī)院普外科（王建軍）

凌志強，E-mail:lingzq@hotmail.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the relationship of TIMP-3 gene CpG island methylation with the invasiveness and prognosis of gastric cancer. Methods Tissue samples were collected from 92 cases of gastric cancer patients,48 cases of gastritis and 40 healthy subjects.Methylation levels of the TIMP-3 gene promoter CpG islands were detected by methylation-specific real-time polymerase chain reaction(qMSP).The relationship of TIMP-3 gene ectopic methylation with invasiveness and prognosis for gastric cancer patients was analyzed. Results TIMP-3 gene methylation was detected in 63.0%of gastric cancer tissues and 4.4%of the paired pericancerous mucosa.TIMP-3 gene methylation was not detected in all samples from gastritis patients and normal controls.TIMP-3 gene methylation levels were correlated with tumor size,growth type,differentiation,lymphatic invasion,vein invasion,invasion depth,lymph node metastasis and clinical stage of gastric cancer(P＜0.05).On the contrary,there was no correlation of TIMP-3 gene methlylation with gender,age,Hp infection status,lesion site and distant metastasis(P＞0.05).Survival analysis showed that patients with non-methylated TIMP-3 gene had an independent survival advantage(P＜0.001). Conclusion TIMP-3 gene methylation is correlated with the degree of malignancy and poor prognosis of gastric cancer.