應(yīng)激狀態(tài)下兔甲狀腺功能及炎癥因子的變化

胡江 段淑芳 鄒玉婷 王亞麗 李能娟 繆菁

應(yīng)激狀態(tài)下兔甲狀腺功能及炎癥因子的變化

胡江 段淑芳 鄒玉婷 王亞麗 李能娟 繆菁

目的 觀察應(yīng)激狀態(tài)下甲狀腺功能及相關(guān)炎癥因子的變化規(guī)律，分析非甲狀腺性的病態(tài)綜合征（NTIS）時(shí)甲狀腺功能及炎癥因子的變化與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。 方法 30只家兔隨機(jī)取24只用55%氫氟酸燒傷5%體表面積。傷前5min，傷后2、8、24、72、168、336h分別采集靜脈血3ml，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）和促甲狀腺素（TSH），ELISA方法檢測(cè)血清熱休克蛋白（HSP）、TNF-α、IL-6。 結(jié)果 （1）家兔燒傷應(yīng)激后于24h內(nèi)死亡5只，死亡率為20.8%，之后分別于48、72h各死亡2只，總死亡率37.5%。與對(duì)照組比較，燒傷應(yīng)激后的存活組家兔的FT3于傷后8h下降顯著（P＜0.05）, FT4、TSH于傷后24h下降顯著（P＜0.05），F(xiàn)T3、FT4、TSH均于24h達(dá)最低點(diǎn)（P＜0.05），隨后血FT3、FT4、TSH濃度水平逐步升高，于傷后168h基本升至傷前水平，與傷前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。（2）與正常對(duì)照組比較，燒傷應(yīng)激后的存活組家兔的HSP、TNF-α均在8～24h升至平臺(tái)期（P＜0.05），之后逐漸恢復(fù)正常，早于甲狀腺功能的變化，IL-6也在8h達(dá)高峰，但是峰值變化更大（P＜0.01），持續(xù)時(shí)間更久。（3）死亡組與存活組比較，甲狀腺功能變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），HSP、TNF-α、IL-6均明顯增高（P＜0.05），其中IL-6變化更大（P＜0.01）。 結(jié)論 家兔皮膚燒傷后甲狀腺功能隨病程的延長(zhǎng)呈現(xiàn)規(guī)律變化，24h內(nèi)甲狀腺功能達(dá)最低水平，之后逐漸自行恢復(fù)，呈“U”型曲線變化，與炎癥因子HSP、TNF-α、IL-6變化相關(guān)。

應(yīng)激狀態(tài) 非甲狀腺性的病態(tài)綜合征 炎癥因子

Stress status The nonthyroidal illness syndrome Inflammatory cytokines

非甲狀腺性的病態(tài)綜合征（the nonthyroidal illness syndrome，NTIS）又稱甲狀腺功能正常性病態(tài)綜合征，是指急、慢性非甲狀腺疾病對(duì)正常甲狀腺功能參數(shù)的影響，如低T3、T4綜合征，而甲狀腺本身無器質(zhì)性病變。甲狀腺激素的變化與基礎(chǔ)疾病的嚴(yán)重程度和病期有關(guān)，而與疾病的種類無關(guān)。常見于禁食和慢性營養(yǎng)不良、重癥感染、燒傷、大手術(shù)和創(chuàng)傷，心、肝、腎疾病或功能衰竭等多種疾病[1-2]。各種應(yīng)激導(dǎo)致外周5′-脫碘酶作用受抑制，活性減低，使T4向T3轉(zhuǎn)化減少，從而出現(xiàn)低T3綜合征，當(dāng)疾病進(jìn)一步發(fā)展，T4與甲狀腺激素結(jié)合蛋白結(jié)合受到抑制，血漿白蛋白、甲狀腺結(jié)合球蛋白減少，肝臟對(duì)甲狀腺激素的攝取與代謝異常，可出現(xiàn)TT4減少，出現(xiàn)低T4綜合征[3]。NTIS在不同的患者群中發(fā)病原因是多種多樣的，基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子參與起病，晚近研究證實(shí)，NTIS發(fā)生時(shí)不僅外周甲狀腺激素的代謝發(fā)生改變而且下丘腦及垂體激素也發(fā)生了改變[4]。

NTIS是機(jī)體在疾病或應(yīng)激時(shí)的一種保護(hù)性改變還是機(jī)體適應(yīng)不良的結(jié)果并不清楚[5]。因此，目前對(duì)于NTIS是否進(jìn)行藥物干預(yù)以及干預(yù)的最佳時(shí)間尚無共識(shí)?，F(xiàn)有的循證研究提示，對(duì)于非危重疾病導(dǎo)致的NTIS，甲狀腺素的補(bǔ)充治療不予推薦。所以本研究觀察家兔氫氟酸燒傷誘導(dǎo)的應(yīng)激狀態(tài)下甲狀腺功能及相關(guān)炎癥因子的變化規(guī)律，分析NTIS時(shí)甲狀腺功能及炎癥因子的變化與轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，為臨床治療提供證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年家兔30只（新西蘭兔4～5月齡，普通級(jí)）（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。雌雄不拘，體重1.8～2.5kg，單籠飼養(yǎng)，予統(tǒng)一飼料一級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)喂養(yǎng)，2周后供實(shí)驗(yàn)用。55%氫氟酸（分析純）購自中外合資上海遠(yuǎn)大過氧化物有限公司（批號(hào)200806222，常溫保存）。ELISA試劑盒（HSP、TNF-α、IL-6）購自上海逸峰生物科技有限公司（批號(hào) ZLZDBZZH01）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟 30只家兔一側(cè)背部，腹部及頸部前區(qū)的皮膚剪毛，8%硫化鈉脫毛后固定于專用實(shí)驗(yàn)架上，以50mg/kg硫賁妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，實(shí)驗(yàn)燒傷前抽靜脈血供甲狀腺功能檢查。隨機(jī)選取24只進(jìn)行氫氟酸燒傷，保留6只作為對(duì)照組。24只實(shí)驗(yàn)兔按9.8W2/3公式計(jì)算5%體表面積（W為體重kg）,龍膽紫圈出，在通風(fēng)柜內(nèi)用紗布團(tuán)蘸氫氟酸涂布于實(shí)驗(yàn)皮膚1min，立即用流動(dòng)清水沖洗5min，分別于傷后2、8、24、72、168、336h頸靜脈抽血檢測(cè)FT3、FT4和TSH，以及熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、TNF-α和IL-6。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 存活兔按時(shí)間段分別取非抗凝靜脈血3ml，死亡兔在接近死亡時(shí)（指死亡前末次取血）抽取非抗凝靜脈血3ml，運(yùn)用美國BECKMAN Access化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)FT3、FT4和TSH。ELISA方法檢測(cè)血清HSP、TNF-α、IL-6（具體操作步驟依照說明書進(jìn)行）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氫氟酸燒傷前后存活組家兔甲狀腺功能變化 FT3、FT4于傷后逐步下降，與對(duì)照組比較，傷后8h FT3有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），傷后24h FT4有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05)。FT3和FT4均在24h達(dá)最低水平后逐步升高，傷后168h基本升至傷前水平，傷后336h趨于平穩(wěn)，與傷前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。TSH逐步下降，于傷后24h降至最低點(diǎn)，與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），隨后TSH水平逐步升高，傷后168h趨于平穩(wěn)，與傷前比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 存活組家兔皮膚燒傷前后甲狀腺功能變化

2.2 存活組家兔燒傷前后炎癥相關(guān)指標(biāo)HSP、TNF-α、IL-6變化 家兔氫氟酸燒傷后，HSP、TNF-α均在8h達(dá)高峰，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），8～24h處于平臺(tái)期，之后水平逐漸下降，早于甲狀腺功能的變化，而IL-6也在8h達(dá)高峰，但與對(duì)照組比較峰值變化更大（P＜0.01），持續(xù)時(shí)間更久，在336h后才能逐漸回歸至基礎(chǔ)水平，見表2。

表2 存活組家兔皮膚燒傷前后HSP、TNF-α、IL-6變化（pg/ml）

2.3 死亡組與存活組甲狀腺功能變化比較 家兔燒傷應(yīng)激后24h內(nèi)死亡5只，死亡率為20.8%，之后分別于48、72h各死亡2只，總死亡率37.5%。選取存活組甲狀腺功能差異最顯著的24h時(shí)間段為參考，與對(duì)照組和死亡組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見表3。

2.4 死亡組與存活組HSP、TNF-α、IL-6比較 與對(duì)照組和存活組甲狀腺功能差異最顯著的24h時(shí)間段比較，死亡組HSP、TNF-α、IL-6均明顯高于其余兩組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中IL-6變化更大（P＜0.01），見表4。

表3 3組家兔甲狀腺功能變化比較

表4 3組家兔HSP、TNF-α、IL-6變化比較（pg/ml）

3 討論

NTIS是在各種應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)的甲狀腺功能改變，表現(xiàn)為血清T3的降低，反T3（rT3）水平升高，促甲狀腺激素、血清T4正?；蚪档?，而臨床無甲狀腺疾病表現(xiàn)。甲狀腺功能變化的程度，尤其是T4變化程度，反映了病情的輕重，是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)之一[6-7]。在重癥監(jiān)護(hù)室，NTIS中有70%表現(xiàn)為低T3，而50%表現(xiàn)為低T4[8]。也有研究證明在校正其它混雜因素后，非急性疾病的老年患者生存時(shí)間僅與rT3相關(guān)[9]。但是，NTIS是否需進(jìn)行藥物干預(yù)，目前仍存在爭(zhēng)議[10]。所以觀察應(yīng)激狀態(tài)下甲狀腺功能變化以及治療后病死率與甲狀腺功能變化的相關(guān)性，具有實(shí)際的臨床指導(dǎo)意義

目前研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子HSP、IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α與NTIS相關(guān)，它們不僅抑制甲狀腺本身，也與甲狀腺功能異常所致的體內(nèi)急性心肌缺血再灌注損傷和病死率增加有關(guān)[11-12]，同時(shí)對(duì)垂體產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致部分患者TSH血濃度可低于正常[13-15]。尤其是HSP，它是一種內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)蛋白，嚴(yán)重?zé)齻皞笤缙趯?dǎo)致的組織細(xì)胞缺血缺氧、炎癥介質(zhì)釋放、細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生等多種因素應(yīng)激后會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生高濃度HSP分泌，防止應(yīng)激引起的細(xì)胞損害或使受損的細(xì)胞恢復(fù)。另外，在應(yīng)激早期腎上腺糖皮質(zhì)激素的作用也可多水平影響下丘腦-垂體-甲狀腺軸的功能。

在NTIS的動(dòng)物模型中，燒傷是一種簡(jiǎn)單易行的誘導(dǎo)方法，Mebis等[15]研究發(fā)現(xiàn)雄性的新西蘭大白兔麻醉后，燒傷面積達(dá)體表面積的15%～20%時(shí)，燒傷組較對(duì)照組T3、TSH明顯降低，T4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且燒傷組下丘腦組織中甲狀腺素受體的表達(dá)變化不明顯。Debaveye等[16]也通過上述方法造模，發(fā)現(xiàn)燒傷可致T3、T4水平顯著下降。所以本研究采用燒傷建立NTIS的動(dòng)物模型。氫氟酸具有較強(qiáng)腐蝕性，當(dāng)與皮膚接觸時(shí)氟離子即穿透皮膚進(jìn)而與組織中鈣離子結(jié)合導(dǎo)致低鈣血癥威脅生命。已有研究顯示氫氟酸皮膚燒傷后患者甲狀腺素的動(dòng)態(tài)變化與預(yù)后有直接關(guān)系。所以本研究選用氫氟酸作為誘導(dǎo)劑，測(cè)定氫氟酸燒傷后的甲狀腺素變化，為臨床治療提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示：家兔氫氟酸燒傷誘導(dǎo)的應(yīng)激狀態(tài)下FT3、FT4、TSH均有下降，其中FT3最先發(fā)生變化，傷后8h下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)T4、TSH于傷后24h降至最低點(diǎn)，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，相關(guān)細(xì)胞因子HSP、TNF-α、IL-6均在8h明顯升高，其中HSP、TNF-α于24h達(dá)平臺(tái)期后逐漸下降，與甲狀腺功能變化一致，但又早于后者的發(fā)生，之后細(xì)胞因子表達(dá)下降，甲狀腺功能逐漸改善，168h后與對(duì)照組比較差異不明顯，但是IL-6變化峰值更高，持續(xù)時(shí)間更久，336h才能恢復(fù)成對(duì)照組水平。表明氫氟酸皮膚燒傷不僅對(duì)甲狀腺功能抑制，同時(shí)對(duì)垂體軸TSH也存在抑制，其中FT3變化早于FT4也與甲狀腺本身功能特點(diǎn)有關(guān)，HSP、TNF-α、IL-6可能為燒傷應(yīng)激所致甲狀腺功能變化的分子因素，其中IL-6較HSP、TNF-α起著更重要的作用。

在應(yīng)激狀態(tài)下，家兔總死亡率為37.5%，其中24h內(nèi)死亡率達(dá)20.8%，死亡組和存活組24h的甲狀腺功能存在顯著差異，提示燒傷應(yīng)激后合并NTIS在24h內(nèi)的死亡率高。但是在不進(jìn)行藥物干預(yù)的情況下，F(xiàn)T3、FT4、TSH濃度水平也能自行逐步修復(fù)，于傷后168h基本升至傷前水平，傷后336h趨于平穩(wěn)，與傷前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示在不進(jìn)行藥物干預(yù)的情況下，燒傷應(yīng)激168h后甲狀腺功能也能自行恢復(fù)，因此24h之后的藥物干預(yù)臨床價(jià)值不大，表明NTIS的藥物干預(yù)可能具有時(shí)間選擇性。

綜上所述，家兔氫氟酸皮膚燒傷中毒后，甲狀腺功能24h內(nèi)達(dá)最低峰，之后甲狀腺功能逐漸自行恢復(fù)，呈“U”型曲線，與相關(guān)細(xì)胞因子的改變一致，提示氫氟酸皮膚燒傷后家兔垂體-甲狀腺軸表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)改變過程，與細(xì)胞因子HSP、TNF、IL-6變化相關(guān)。同時(shí)家兔燒傷后總死亡率為37.5%，24h內(nèi)死亡率達(dá)20.8%，之后隨著甲狀腺功能逐漸恢復(fù)，死亡率減低。推測(cè)NTIS藥物最佳干預(yù)時(shí)間可能為傷后24h，對(duì)于診治NTIS有一定參考價(jià)值。

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2012-07-30）

（本文編輯：胥昀）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金計(jì)劃（2007B240）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201016834）

310005 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科

胡江，E-mail:qzhujiang@126.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the change of thyroid function and inflammatory cytokines in stress status,to provide pathophysiological foundation of nonthyroidal illness syndrome (NTIS). Methods The 5%body surface area was burned with 55%hydrofluoric acid in 24 rabbits.The venous blood samples were collected on 5 min before and 2,8,24,72,168,336h after the injury.Free triiodothyronine(FT3),free thyroxine(FT4)and thyrotropin(TSH)were detected by chemiluminescence method,and the heat shock protein(HSP),tumor necrosis factor(TNF-α),interleukin 6(IL-6)were detected by ELISA method.Results Five rabbits died in 24 h,2 died in 48 h and another 2 died in 72 h with the total mortality rate of 37.5%.The FT3level of the alive group declined significantly in 8h (P＜0.05),the FT4,TSH levels reached lowest points in 24h,then the FT3,FT4and TSH level began to rise gradually and returned to the baseline levels after 168h (P＞0.05).HSP,TNF-α and IL-6 changed earlier than the thyroid function.The platform period of HSP,TNF-α and IL-6 of the alive group appeared in 8-24 h,then returned to the normal level gradually(P＜0.05).IL-6 reached peak level at 8h,the changed markedly and lasted longer(P＜0.01).The thyroid function between the fatal group and the alive group had significant differences(P＜0.05).The changes of HSP,TNF-α and IL-6 in the fatal group were more prominently compared to the alive group (P＜0.05),especially for IL-6 (P＜0.01). Conclusion The thyroid function in rabbits under burn stress presents U-shaped changes,which are correlated with the levels of inflammatory cytokines.