錢大文，周鴻凱 ，江大可，孫澤榮，陳曉宏，袁建活

(廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江524088)

鹽害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最主要的非生物逆境之一［1］，世界上約有20%的耕地和近一半的灌溉地受到鹽脅迫的危害。在全球變暖的大環(huán)境下，全球海平面近10 多年來(lái)在加速上升。海平面上升將引發(fā)海水入侵、土壤鹽漬化等問(wèn)題，從而加劇耕地受鹽脅迫的危害程度。如何利用和開(kāi)發(fā)鹽漬化土地，提高作物產(chǎn)量和改善生態(tài)環(huán)境是全世界100 多個(gè)國(guó)家面臨的重大課題，各國(guó)科學(xué)家為此均做出了不懈的努力?？茖W(xué)家們?cè)噲D克隆出耐鹽基因并轉(zhuǎn)移到目標(biāo)作物(如水稻、小麥、玉米、甘蔗、大豆等)中，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)作物具有較強(qiáng)的耐鹽性，以保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展。如，Delauney 等［2］通過(guò)轉(zhuǎn)入P5CS 基因來(lái)提高植物的抗?jié)B透脅迫能力。Sawahel 等［3］通過(guò)花粉管法把P5CS 基因?qū)胄←?。Capell 等［4］將多胺合成酶基因轉(zhuǎn)入水稻，提高了水稻的耐逆性。Samis和Bowley［5］將Mn -SOD 基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，其抗逆能力和生物產(chǎn)量皆有提高。植物耐鹽相關(guān)基因的研究主要涉及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、離子區(qū)域化、大分子蛋白、基因表達(dá)的調(diào)控、保護(hù)酶等。

海馬齒(Sesuvium portulacastrum L.)又名濱水菜、蟳螯菜或豬母菜，番杏科海馬齒屬植物，是一種多年生肉質(zhì)喜沙的兼性多年生肉質(zhì)草本植物，生長(zhǎng)在海邊沙地或鹽堿地。海馬齒在鹽漬和非鹽漬條件下均能生長(zhǎng)，并能完成其生活史，擁有一套有別于淡土植物的遺傳背景和耐鹽堿生理機(jī)制，屬于典型的鹽生植物，其耐鹽特性屬于誘導(dǎo)性狀［6］。對(duì)高鹽、干旱和重金屬離子具有很高的耐受性，如Messeddi 等［7］的研究認(rèn)為，即使在高達(dá)1 mol/L 的NaCl 濃度下海馬齒仍能生長(zhǎng)，雖生長(zhǎng)顯著減緩，但不會(huì)導(dǎo)致鹽離子中毒或礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素缺乏等癥狀的發(fā)生。大量資料表明了脯氨酸累積與植物對(duì)干旱和鹽脅迫適應(yīng)性之間表現(xiàn)出正相關(guān)性［8］，而海馬齒是一種高積累脯氨酸植物［9，10］，所以海馬齒具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。Ramani 等［11］以液質(zhì)聯(lián)用法研究鹽度對(duì)堿苑(Aster tripolium)和海馬齒(Sesuvium portulacastrum)中硫脂物質(zhì)含量的影響，結(jié)果表明，后者較前者具有更強(qiáng)的鹽度耐受性;Inès 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，成年的海馬齒植株對(duì)長(zhǎng)時(shí)間缺水有很強(qiáng)的忍耐性，在恢復(fù)澆水后能繼續(xù)生長(zhǎng)。因此，海馬齒對(duì)于鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用、改善生態(tài)環(huán)境、提供耐鹽堿基因等方面，具有很重要的實(shí)際利用潛力。

自20 世紀(jì)八九十年代以來(lái)，零星報(bào)道了鹽脅迫下海馬齒植株內(nèi)氨基酸和礦物質(zhì)等組分變化［12-13］，真正的系統(tǒng)研究則始于21 世紀(jì)，對(duì)海馬齒耐鹽、耐旱及耐重金屬鎘離子(Cd2+)的生理機(jī)制方面作了較多研究報(bào)道［7，14-15］，并開(kāi)展分子遺傳多樣性、抗鹽生理與分子機(jī)制、生態(tài)修復(fù)和經(jīng)濟(jì)用途等［16］方面的研究。但是，在鹽脅迫下海馬齒植株內(nèi)脯氨酸合成積累的途徑及其相關(guān)酶的活性方面的研究，仍為鮮見(jiàn)報(bào)道。本文以生長(zhǎng)在雷州半島海邊的海馬齒(Sesuvium portulacastrum L.)為材料，初步探討了在鹽脅迫條件下海馬齒植株體內(nèi)游離脯氨酸合成累積的途徑及其P5CS、δ -OAT、SOD、POD 活性，以期為海馬齒的開(kāi)發(fā)利用、鹽生植物的耐鹽生理機(jī)制探索、發(fā)掘新的耐鹽堿基因提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料

于2010 年7 月5 日，在雷州半島流沙灣的海灘上采集野生的海馬齒(Sesuvium portulacastrum L.)回廣東海洋大學(xué)培植，用海水澆灌。兩個(gè)月后，選取生長(zhǎng)均勻的植株，均勻剪取15 cm 長(zhǎng)的苗莖24 段為種苗。試驗(yàn)的土壤為礫質(zhì)沙土。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽試驗(yàn)的方法，3 次重復(fù)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。選用高25 cm、口徑30 cm 的花盆，每盆裝干礫質(zhì)沙土2.0 kg;鹽脅迫處理為施用NaCl 溶液。試驗(yàn)在玻璃溫室進(jìn)行，于2010 年9 月5 日，將36 段種苗按每盆2 株分別種入18 個(gè)花盆，種苗入土深度為8 cm，用營(yíng)養(yǎng)液(體積比1∶1的海水和0.2%荷蘭復(fù)合肥液臨時(shí)混合液)澆淋500 mL。以后每天澆淋營(yíng)養(yǎng)液200 mL，培育25 d、主莖長(zhǎng)度達(dá)25 cm 時(shí)，每天用200 mL 自來(lái)水澆5 d 后，按NaCl 的6 個(gè)處理水平(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol·L-1)施用相應(yīng)濃度的溶液200 mL，48 h 后取樣(主莖頂端的嫩莖及葉片為測(cè)試樣本，土壤的含水量為8.78% ±0.16%)分析測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法

脯氨酸含量測(cè)定按照Bates 等［17］的方法;⊿1-毗咯琳-5 -羧酸合成酶(P5CS)的提取按照Kavi等［8］的方法，P5CS 的活性測(cè)定按照Garcia -Rios［18］的方法進(jìn)行;鳥(niǎo)氨酸-δ -氨基轉(zhuǎn)移酶(δ -OAT)的提取按照Delauney 等［2］的方法進(jìn)行，δ -OAT 活性測(cè)定按Kim 等［19］的方法;超氧歧化酶(SOD)的測(cè)定按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，試劑配置按照說(shuō)明書(shū)操作;過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［20］。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS10.3 在PC 機(jī)上進(jìn)行，用Duncan 法測(cè)定處理間各生理指標(biāo)的差異顯著性(P ＜0.05)，并在圖中進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離脯氨酸積累量分析

圖1 表明，NaCl 處理?xiàng)l件下，海馬齒植物體內(nèi)的游離脯氨酸有顯著的積累效應(yīng):0.2 mol·L-1處理水平的游離脯氨酸量顯著地比0 mol·L-1處理水平(CK)增加14.5%;0.6 mol·L-1水平的游離脯氨酸量達(dá)到高峰值347 μmol·g-1(FW)，比CK 增加達(dá)33.5%;而后游離脯氨酸量開(kāi)始下降。這一結(jié)果表明，在NaCl 的肋迫下，海馬齒植物體內(nèi)游離脯氨酸的積累量顯著地增加，但在高濃度水平(0.8 mol·L-1)NaCl 的肋迫下，海馬齒的游離脯氨酸的量又顯著地下降。

圖1 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)游離脯氨酸的含量

2.2 δ-OAT 的活性分析

由圖2 可看出，NaCl 的施用對(duì)海馬齒體內(nèi)δ -OAT 酶的活性有激活效應(yīng)，但隨NaCl 的施用水平不同，δ-OAT 酶的活性有所差異。0.2mol·L-1處理水平的δ-OAT 酶的活性顯著地比0mol·L-1處理水平(CK)增強(qiáng)3.1%;在0.4mol·L-1水平上δ -OAT 酶的活性達(dá)到最大值，顯著地比CK 增強(qiáng)10.1%;隨后δ-OAT 酶的活性逐步地降低。

圖2 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)δ-OAT 的活性變化

2.3 P5CS 的活性分析

由圖3 可知，NaCl 對(duì)海馬齒體內(nèi)P5CS 酶的活性產(chǎn)生顯著的激活效應(yīng)，但由于NaCl 的處理脅迫水平不同，其P5CS 酶的活性有顯著的差異性:0.2 mol·L-1處理水平的P5CS 酶的活性顯著地比0 mol·L-1處理水平(CK)增強(qiáng)26.7%;在0.6 mol·L-1水平上達(dá)到高峰值，比CK 增強(qiáng)46.1%;以后，P5CS 酶的活性顯逐步降低的趨勢(shì)。

圖3 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)P5CS 的活性變化

2.4 SOD 的活性分析

圖4 表明，NaCl 的6 個(gè)處理水平上，海馬齒的植物體內(nèi)的SOD 活性有顯著的差異性:0.2 mol·L-1處理水平的植物體內(nèi)的SOD 活性比CK 顯著地增強(qiáng)了70.2%;在0.6 mol·L-1水平上，其植物體內(nèi)的SOD 活性達(dá)到高峰，顯著地比CK 增強(qiáng)了1.38 倍。

圖4 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)SOD 的活性變化

2.5 POD 的活性分析

圖5 表明，NaCl 的6 個(gè)處理水平上，海馬齒的植物體內(nèi)的POD 活性有顯著的差異性0.2 mol·L-1處理水平的植物體內(nèi)的POD 活性比CK 顯著地增強(qiáng)了59.6%;在0.6 mol·L-1水平上，其植物體內(nèi)的POD 活性達(dá)到高峰，顯著地比CK 增強(qiáng)了1.28 倍。

圖5 NaCl 脅迫下海馬齒植株體內(nèi)POD 的活性變化

3 討 論

3.1 海馬齒在NaCl 脅迫下，植株內(nèi)游離脯氨酸的合成積累途徑

植物的脯氨酸合成、累積及代謝是一個(gè)受非生物脅迫和細(xì)胞內(nèi)脯氨酸濃度高度調(diào)控的生理生化過(guò)程。脯氨酸代謝與生物體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝過(guò)程相關(guān)聯(lián)，包括合成途徑和降解途徑。脯氨酸的合成途徑發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，而降解途徑發(fā)生在線粒體中，這種代謝的區(qū)域化分布避免了物質(zhì)的無(wú)效循環(huán)［21］。雖然對(duì)植物體內(nèi)累積脯氨酸的可能途徑看法不一［22-23］，但一般認(rèn)為滲透脅迫過(guò)程中高等植物脯氨酸的累積主要是由從頭合成引起的［22］，并且認(rèn)為谷氨酸和鳥(niǎo)氨酸是脯氨酸合成的可能前體。產(chǎn)生脯氨酸的生物合成途徑分別稱為谷氨酸途徑［24］和鳥(niǎo)氨酸途徑［2］。每一個(gè)途徑都受到關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，⊿1-毗咯琳-δ-羧酸合成酶(P5CS)和δ -鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)分別是這兩個(gè)途徑的關(guān)鍵酶［25，26］。在鹽、干旱、重金屬等逆境的脅迫下，哪一種途徑對(duì)脯氨酸累積的影響占據(jù)主導(dǎo)地位，這與植物的種類、生理狀態(tài)和植物體內(nèi)的氮素水平有關(guān)［2，27］。Roosens等［28］以4 周齡的擬南芥為材料的研究表明，鹽脅迫下植株內(nèi)游離脯氨酸的增加主要是由于Glu→Pro途徑引起的，而趙福庚等［29］的研究認(rèn)為，鹽脅迫可以明顯激活大麥幼苗體內(nèi)脯氨酸合成的鳥(niǎo)氨酸途徑，使得Orn→Pro 途徑成為脯氨酸合成積累的主要途徑。余光輝等［30］的研究認(rèn)為，在水分脅迫條件下，脯氨酸累積的規(guī)律性與δ -OAT 的活性變化呈現(xiàn)出很好的相關(guān)性，而與P5CS 的活性呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明假儉草植物脯氨酸的累積主要受到δ -OAT 的活性調(diào)節(jié)。本研究表明，海馬齒在NaCl 脅迫下，植株內(nèi)的δ - OAT 和P5CS 活性均被顯著地激活，δ -OAT 的活性在0.2 mol·L-1處理水平時(shí)比CK 增強(qiáng)3.1%，在0.4 mol·L-1水平達(dá)到最大值(比CK 增強(qiáng)10.1%);而P5CS 的活性在0.2 mol·L-1處理水平就顯著地比CK 增強(qiáng)26.7%，在0.6 mol·L-1水平上達(dá)到高峰值(比CK 增強(qiáng)46.1%)，并與游離脯氨酸積累量同步。因此，可以推斷:海馬齒受到NaCl 脅迫時(shí)，P5CS 和δ -OAT 的活性均被激活，其植株內(nèi)合成脯氨酸的兩條途徑(Glu→Pro 和Orn→Pro)均被啟動(dòng)合成積累游離脯氨酸，但是以Glu→Pro 途徑為主，Orn→Pro 途徑為輔。這些研究結(jié)果表明，植物的游離脯氨酸合成積累是一個(gè)十分復(fù)雜的生理生化過(guò)程，涉及到多個(gè)基因的表達(dá)，植株內(nèi)游離脯氨酸積累的數(shù)量是多種生理生化反應(yīng)綜合作用的結(jié)果?，F(xiàn)有的研究表明，除脯氨酸的合成酶受激活外，還有其它的一些酶如脯氨酸運(yùn)輸酶［31］、谷氨酰胺合成酶［32］等也參與了脯氨酸的累積過(guò)程。因此，高等植物體內(nèi)游離脯氨酸合成積累的機(jī)制，還有待于從植物細(xì)胞信號(hào)傳遞、脯氨酸運(yùn)輸、相關(guān)酶的作用機(jī)制等方面的進(jìn)一步研究的揭示和證明。

3.2 海馬齒在NaCl 脅迫下，植株內(nèi)游離脯氨酸的積累效應(yīng)

在NaCl 脅迫下海馬齒植株內(nèi)游離脯氨酸有顯著的積累效應(yīng)，在0.6 mol·L-1處理水平時(shí)達(dá)到積累的高峰值347μmol·g-1(FW)，而后在0.8 mol·L-1的高濃度脅迫水平時(shí)，游離脯氨酸的積累量顯著地降低。同時(shí)，與脯氨酸的合成、代謝有關(guān)的δ -OAT、P5CS、POD、SOD 的活性也呈現(xiàn)出與游離脯氨酸積累量一樣的趨勢(shì)，不過(guò)δ-OAT 活性在0.4 mol·L-1處理水平達(dá)到高峰期。表明了在一定濃度水平的NaCl 脅迫下，海馬齒植株體內(nèi)δ -OAT、P5CS 的活性均被顯著地激活，合成脯氨酸的兩個(gè)途徑(Glu→Pro 和Orn→Pro)同時(shí)加強(qiáng)合成和積累脯氨酸，促進(jìn)植株體內(nèi)的游離脯氨酸快速積累。同時(shí)，由于植株體內(nèi)的游離脯氨酸快速積累，植株體內(nèi)SOD、POD的活性也被顯著地激活，有效清除O-2、OH 和1O2等活性氧(ROS)的積累，緩解NaCl 導(dǎo)致的氧化脅迫，從而進(jìn)一步提高植物的抗氧化能力。而當(dāng)NaCl 的濃度過(guò)高時(shí)，這些酶的活性降低，植株體內(nèi)的游離脯氨酸合成與積累受阻，導(dǎo)致植株體內(nèi)的游離脯氨酸含量下降。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了，海馬齒是一種高度耐鹽植物。海馬齒具有這種高耐鹽特性，正是人類探索、發(fā)掘新的耐鹽堿基因重要來(lái)源之一。

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