劉 亮，鄭曉梅，楊福兵，王 斌，包長順，陳禮剛

ADAMDEC1具有金屬內(nèi)肽酶、整聯(lián)蛋白結(jié)合的活性，參與蛋白水解，負(fù)調(diào)控細(xì)胞附著，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[1-2]。已有研究顯示，ADAMDEC1在顱咽管瘤組織中可過度表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要而復(fù)雜的作用。因此，從腫瘤細(xì)胞表達(dá)ADAMDEC1基因的角度來研究人顱咽管瘤細(xì)胞生長增殖的機(jī)制，對認(rèn)識腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制以及基因治療等具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 顱咽管瘤細(xì)胞，由我室自行經(jīng)原代培養(yǎng)獲得[3]。Trizol提取液購自美國Rothe公司，Western bloting試劑購自Amersco公司，RT-PCR試劑盒購自大連寶生物技術(shù)發(fā)展中心，DNA Marker DL2000購自寶生物工程有限(大連)公司，即用型SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購自美國DAKO公司，鼠抗人ADAMDEC1單克隆抗體購自美國Santa公司，DNA Marker購自北京新長江生物科技有限公司，重組人生長激素(rhGH)購自長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將處于對數(shù)生長期的顱咽管瘤細(xì)胞3×103/ml培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10 ng/ml、100 ng/ml、1 000 ng/ml的rhGH，對照組加入不含rhGH的等體積的培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR檢測顱咽管瘤細(xì)胞ADAMDEC1 mRNA的表達(dá) 用RNAiso Plus試劑盒提取實(shí)驗(yàn)組與對照組顱咽管瘤細(xì)胞的總RNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度，計(jì)算樣品的總RNA濃度。利用Primer 5自行設(shè)計(jì)引物，交由上海英俊公司合成，采用人穩(wěn)定表達(dá)的基因β-actin作參照，序列如下，ADAMDEC1上游引物：5′-CATCTTCGGTTGCTGTTATT-3′，下游引物：5′-CACTCTGTGGTATGGTTTGG-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物長度：424 bp，退火溫度：58.2 ℃。β-actin上游引物：5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′，下游引物：5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度：266 bp，退火溫度：56 ℃。按照Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58.2 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由Bio-Rad凝膠成像儀拍攝PCR產(chǎn)物凝膠圖像，并用Quantity One軟件進(jìn)行相對定量分析。以目的條帶和內(nèi)參β-actin的灰度比值來判斷ADAMDEC1 mRNA表達(dá)的高低。

1.2.3 Western bloting檢測ADAMDEC1蛋白在顱咽管瘤細(xì)胞中的表達(dá) 將實(shí)驗(yàn)組與對照組顱咽管瘤細(xì)胞用PBS洗滌3次，再根據(jù)蛋白提取試劑盒說明提取蛋白。采用Bradford方法檢測蛋白濃度。等量的蛋白(25 μg)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(8%)電泳，采用半干法將凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1.5 h，再分別與鼠抗人ADAMDEC1單克隆抗體(1∶300)和鼠抗人β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，與二抗生物素化兔抗鼠IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，與ECL試劑反應(yīng)。采用Bio-Rad凝膠成像儀拍攝凝膠圖像，并用Quantity One軟件分析灰度值，以目的蛋白與其對應(yīng)的β-actin灰度值之比來比較目的蛋白表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 rhGH對顱咽管瘤細(xì)胞ADAMDEC1 mRNA表達(dá)的影響 隨著rhGH濃度的增加，ADAMDEC1 mRNA的表達(dá)增加，rhHG 1 000 ng/ml組的表達(dá)最高(見圖1)。并測出顱咽管瘤細(xì)胞ADAMDEC1 mRNA目的基因/內(nèi)參照的吸光度比值，且rhHG 1 000 ng/ml組的比值最高(見表1)。

2.2 rhGH對顱咽管瘤細(xì)胞ADAMDEC1蛋白表達(dá)的影響 隨著rhGH濃度的增加，ADAMDEC1蛋白的表達(dá)增加，rhHG 1 000 ng/ml組的表達(dá)最高(見圖2)。Western bloting檢測各組積分光密度(IOD)值比較(去除β-actin)，rhHG 1 000 ng/ml組的比值最高(見圖3)。

注：M為Marker，1為rhGH 1 000 ng/ml組，2為rhGH 100 ng/ml組，3為rhGH 10 ng/ml組，4為對照組

圖1 RT-PCR檢測各組ADAMDEC1 mRNA的表達(dá)

Figure1 Expression of ADAMDEC1 mRNA in the groups by RT-PCR

注：C：對照組；GL：rhGH 10 ng/ml組；GM：rhGH 100 ng/ml組；GH：rhGH 1 000 ng/ml組

圖2 Western bloting檢測各組ADAMDEC1蛋白的表達(dá)

Figure2 Expression of ADAMDEC1 protein in the groups by Western bloting

注：C：對照組；GL：rhGH 10 ng/ml組；GM：rhGH 100 ng/ml組；GH：rhGH 1 000 ng/ml組

圖3 各組相對灰度值的比較

Figure3 Comparison of the relative value of each gray

表1 顱咽管瘤細(xì)胞ADAMDEC1 mRNA目的基因/內(nèi)參照的吸光度比值

注：與對照組比較，*P<0.05；與rhGH 10 ng/ml組比較，△P<0.05；與rhGH 100 ng/ml組比較，▲P=0.023

3 討論

ADAMDEC1是一種分泌蛋白，屬于解聚素金屬蛋白酶家族。只有部分解聚素域，完全缺乏富含半胱氨酸域。因此，其屬于一種新的ADAM亞科。ADAMDEC1在樹突狀細(xì)胞成熟期間表達(dá)上調(diào)，表明這種蛋白質(zhì)可能會扮演一個(gè)樹突狀細(xì)胞的功能和生發(fā)中心T細(xì)胞相互作用的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)人與小鼠ADAMDEC1基因都位于8p12 染色體上，且ADAMDEC1、ADAM7和ADAM28組成金屬蛋白酶基因群。它們的親緣關(guān)系提示這些蛋白酶擁有相似的功能[4]。Hwang等[2]采用半定量RT-PCR方法檢測了人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)ADAMDEC1過度表達(dá)，從而推測其在腫瘤細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要作用。Crouser等[1]采用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，肺肉樣瘤病組織中，基質(zhì)金屬蛋白酶12和ADAMDEC1高度表達(dá)，超過正常組織的25倍，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)。從而認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶12和ADAMDEC1基因可能參與了肺部的損害或改造，并可作為疾病活動的指標(biāo)。

顱咽管瘤是常見的顱內(nèi)良性腫瘤，因其占位效應(yīng)或侵襲性，干擾垂體和下丘腦功能，導(dǎo)致多種激素分泌不足[5]。無論手術(shù)全切或者放、化療都會加重激素紊亂程度，經(jīng)治療干預(yù)后，生長激素分泌不足發(fā)生率可高達(dá)95%，其中70%的患者需不同程度生長激素替代治療[6]。顱咽管瘤患者絕大多數(shù)為促生長激素釋放激素(下丘腦分泌)-生長激素(垂體前葉分泌)軸損傷，rhGH是主要替代藥物[7]。生長激素分子與其受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8-9]，這種效應(yīng)主要由兩種相關(guān)多肽胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ)、IGF-Ⅱ介導(dǎo)[10]，通過抑制凋亡的發(fā)生，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、刺激血管的形成以及對細(xì)胞外基質(zhì)的重塑等諸多途徑對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有顯著的刺激作用，對已存在的腫瘤有明顯的促生長作用。Gaillard等[11]調(diào)查顯示，在所有生長激素替代治療的患者中，以顱咽管瘤患者的病死率最高，這可能與腫瘤復(fù)發(fā)率較高相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在培養(yǎng)的顱咽管瘤細(xì)胞中，與對照組相比，加入rhGH的實(shí)驗(yàn)組中，其顱咽管瘤細(xì)胞表達(dá)ADAMDEC1的量均增多。且隨著加入rhGH濃度的增加，ADAMDEC1 mRNA的表達(dá)和ADAMDEC1蛋白的表達(dá)均增加，并在rhHG 1 000 ng/ml時(shí)達(dá)到最高。故在體外實(shí)驗(yàn)中，rhGH可以使顱咽管瘤細(xì)胞表達(dá)ADAMDEC1量增多，并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，對于生長激素水平低下的顱咽管瘤患者，在使用rhGH替代治療時(shí)，應(yīng)慎重考慮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖以及復(fù)發(fā)的可能性。

1 Crouser ED，Culver DA，Knox KS，et al.Gene expression profiling identifies MMP-12 and ADAMDEC1 as potential pathogenic mediators of pulmonary sarcoidosis[J].Am J Respir Crit Care Med，2009，179(10)：929-938.

2 Hwang ES，Kim GH.Allyl isothiocyanate influences cell adhesion，migration and metalloproteinase gene expression in SK-Hep1 cells[J].Exp Biol Med(Maywood)，2009，234(1)：105-111.

3 LIU Hao，LIU Liang，ZHI Liu，et al.Establishment of primary cultures of craniopharyngioma cells[J].Neural Regen Res.2012，7(8)：601-605.

4 Mochizuki S，Shimoda M，Shiomi T，et al.ADAM28 is activated by MMP-7(matrilysin-1)and cleaves insulin-like growth factor binding protein-3[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，315(1)：79-84.

5 Tonella P，F(xiàn)lück CE，Mullis PE.Insulin-like growth factor-Ⅰ treatment in primary growth hormone insensitivity：effect of recombinant human IGF-Ⅰ(rhIGF-Ⅰ)and rhIGF-Ⅰ/rhIGF-binding protein-3 complex[J].Horm Res Paediatr，2010，73(2)：140-147.

6 Yang N，Jiang J，Deng L，et al.Growth hormone receptor targeting to lipid rafts requires extracellular subdomain 2[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，391(1)：414-418.

7 Meyer S，Schaefer S，Stolk L，et al.Association of the exon 3 deleted/full-length GHR polymorphism with recombinant growth hormone dose in growth hormone-deficient adults[J].Pharmacogenomics，2009，10(10)：1599-1608.

8 Deng L，Jiang J，F(xiàn)rank SJ.Growth hormone-induced JAK2 signaling and GH receptor down-regulation：role of GH receptor intracellular domain tyrosine residues[J].Endocrinology，2012，153(5)：2311-2322.

9 Renehan AG，Solomon M，Zwahlen M,et al.Growth hormone receptor polymorphism and growth hormone therapy response in children：a Bayesian meta-analysis[J].Am J Epidemiol，2012，175(9)：867-877.

10 Kermani H，Goffinet L，Mottet M，et al.Expression of the growth hormone/insulin-like growth factor axis during Balb/c thymus ontogeny and effects of growth hormone upon ex vivo T cell differentiation[J].Neuroimmunomodulation，2012，19(3)：137-147.

11 Gaillard RC，Mattsson AF，Akerblad AC，et al.Overall and cause-specific mortality in GH-deficient adults on GH replacement[J].Eur J Endocrinol，2012，166(6)：1069-1077.