陳大霞,趙紀(jì)峰,劉翔,王昌華,張植偉,秦松云,鐘國躍

[摘要] 目的：揭示珍稀瀕危藥用植物桃兒七的遺傳多樣性水平及居群遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。方法：采用新型分子標(biāo)記SCoT對來源于我國的6個桃兒七野生居群共45個個體進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測。運(yùn)用POPGEN_E軟件計算相關(guān)遺傳參數(shù)，UPGMA方法聚類，結(jié)合MEGA5軟件生成樹狀圖。結(jié)果：篩選出的27條引物，共檢測到350個位點(diǎn)，其中284個為多態(tài)位點(diǎn)，平均每條引物擴(kuò)增所得多態(tài)條帶為10.52條。物種水平上，桃兒七6個野生居群的遺傳多樣性較為豐富，PPB 79.27%，N_e1.332 7，H 0.210 9，H_sp0.328 6。在居群水平上，遺傳多樣性水平較低： PPB 10.48%（4.00%～23.71%），N_e1.0487（1.020 7～1.103 7），H 0.029 7（0.012 9～0.063 1），Hpop 0.046 2（0.019 9～0.098 6）。Nei′s 基因多樣性指數(shù)計算的居群間遺傳分化系數(shù)G_st=0.841 1與Shannon′s居群分化系數(shù)（H_sp-H_poppop）/H_sp=0.849 4基本一致，均說明大部分遺傳變異存在于居群間?；蛄鱊_m= 0.094 4，表明桃兒七居群間基因交流處于低等水平。Nei′s遺傳一致度（I）范圍為0.570 8～0.978 7。聚類分析將供試居群分為2 類，相同地理來源或相似生境的材料具有聚為一類的傾向。結(jié)論：供試野生桃兒七具有較豐富的遺傳多樣性，為有效保護(hù)和改良種質(zhì)資源奠定了一定的基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 桃兒七；SCoT；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

桃兒七Sinopodophyllum emodi（Wall.）Ying為小檗科桃兒七屬多年生草本植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》中以“鬼臼”之名收載，藥用歷史悠久，其根及根狀莖、果實(shí)均可藥用，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、化痰止咳、解毒的功效，用于風(fēng)濕痹痛、肢體麻木、胃脘疼痛、跌打損傷、勞傷咳嗽等證，并可解鐵棒錘中毒。目前，桃兒七地下部分主要作為抗癌藥物Vp-16（etoposide）等合成的前體物質(zhì)鬼臼毒素（podophyllotoxin）的提取原料，果實(shí)則為藏藥材“小葉蓮”（藏族語稱“奧勒莫色”）。桃兒七為我國特有種，主要分布于陜西、甘肅、青海、四川、云南、西藏等地，生于海拔1 500～4 300 m的高山灌叢、草叢及路旁。目前，桃兒七的人工栽培尚未規(guī)模化，藥材主要來源于野生。在利益的驅(qū)使下，野生桃兒七掠奪式地被大量采挖，致使植被遭受嚴(yán)重破壞，生境急劇惡化，加之藏醫(yī)以其果實(shí)入藥，極大的削弱了群體的天然繁殖能力。目前，桃兒七野生群體數(shù)目和群體規(guī)模在不斷變小，分布區(qū)域日漸縮減，資源面臨瀕危的境地，早在1992年即已被列入《中國珍稀瀕危植物名錄》，并被《中國植物紅皮書-稀有瀕危植物》收錄[1]，為國家三級保護(hù)植物。近年來，人們逐漸認(rèn)識到保護(hù)桃兒七資源的重要意義，并開展了資源分布調(diào)查、野生變家種等保護(hù)工作，但大多數(shù)保護(hù)活動仍然是在缺乏基本的生物學(xué)研究尤其是保護(hù)遺傳學(xué)研究的情況下進(jìn)行的，很難制定科學(xué)的保護(hù)措施。此外，筆者等的研究表明，不同產(chǎn)地與小生境生長的桃兒七（居群），其生物量及地下部分中的鬼臼毒素的含量均存在較大差異[2-3]，提示桃兒七藥材質(zhì)量可能與其遺傳特性有關(guān)。為合理保護(hù)和利用桃兒七資源，有必要研究其遺傳多樣性，分析其遺傳結(jié)構(gòu)。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子標(biāo)記技術(shù)是Collard和Mackill開發(fā)的一種新型目標(biāo)分子標(biāo)記技術(shù)[4]，以其操作簡便、成本低廉、多態(tài)豐富、擴(kuò)增效率高、引物具有通用性等優(yōu)點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性[4-7]或基因差異表達(dá)研究[8-9]。就桃兒七而言，近來許多學(xué)者對桃兒七資源調(diào)查[2]、繁殖生物學(xué)[10]、育苗及栽培技術(shù)[11-12]、生態(tài)適應(yīng)機(jī)制[13]、化學(xué)[3]等方面進(jìn)行了許多研究。關(guān)于桃兒七的遺傳多樣性的研究不多，僅見于肖猛等[14-15]對桃兒七部分來源地的遺傳多樣性進(jìn)行了分析評價。為促進(jìn)桃兒七資源的合理保護(hù)與利用技術(shù)進(jìn)步，本文采用SCoT標(biāo)記技術(shù)對我國6個桃兒七自然居群的遺傳結(jié)構(gòu)和種內(nèi)遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 樣品 桃兒七采集于我國的西藏、青海、四川，共計6 個野生居群，45 個個體，由重慶市中藥研究院秦松云副研究員進(jìn)行物種鑒定。收集當(dāng)年生新鮮幼嫩葉片，洗凈、晾干后，放入裝有硅膠的自封袋，快速干燥，并用GPS定位系統(tǒng)記錄各居群生長的海拔、經(jīng)度及緯度（表1）。

1.2 儀器與試劑 S1000TM Thermal Cycler 熱循環(huán)儀（BIO-RAD），Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD），Smart SpeeTM3000型分光光度計（BIO-RAD公司），DYCZ-24B型電泳槽（北京市六一儀器廠）、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

SCoT引物（上海生工生物工程有限公司）、Trans 2K Plus DN_A Marker （北京全式金）、植物基因組DN_A提取試劑盒（北京天根）、Taq酶（TOYOBO），dNTPs（TaKaRa），SYBR Green核酸染料（北京鼎國代理）、瓊脂糖（進(jìn)口分裝）、其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 基因組DN_A提取 用天根植物基因組DN_A提取試劑盒提取桃兒七基因組DN_A。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DN_A的質(zhì)量，并用紫外分光光度計測定其濃度和純度，將樣品稀釋標(biāo)定到40 mg·L^-1，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SCoT分析 SCoT引物采用Collard和Mackill[1]開發(fā)的引物，由上海生工生物工程有限公司合成，共計36條。隨機(jī)抽取2 個DN_A模板進(jìn)行引物篩選，最終確定27 條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、易于區(qū)分，且重復(fù)性高、穩(wěn)定性好、具有差異的引物用于樣品的多態(tài)性檢測。具體引物、序列見表2。

SCoT-PCR反應(yīng)體系：總體積25 μL，內(nèi)含1×PCR buffer，1.5 mmol·L^-1 Mg2+，200 μmol·L^-1 dNTP，0.4 μmol·L^-1引物，40 ng模板，1 U Taq DN_A聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)行36 個循環(huán)：94 ℃變性1 min， 50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

各取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加1 μL 6×DN_A Lodding Buffer（內(nèi)含染料）混勻后，在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。緩沖系統(tǒng)為1×TAE，電壓150 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距離瓊脂糖凝膠前沿約2～3 cm時停止電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照相、記錄。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 按電泳圖譜上DN_A條帶的“有”或“無”進(jìn)行統(tǒng)計，同一位置有條帶（擴(kuò)增陽性）記為“1”，無條帶（擴(kuò)增陰性）記為“0”，形成“0”和 “1”組成的原始矩陣后，輸入計算機(jī)。采用POPGEN_E 1.31軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算參數(shù)包括多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB），Shannon′s多樣性信息指數(shù)（H_o，在物種水平上為H_sp，在居群水平上為H_pop），Nei′s基因多樣度指數(shù)（H） 、平均每個位點(diǎn)的觀察等位基因數(shù)（N_a）、平均每個位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（N_e）、總的基因多樣度（Ht ）、居群內(nèi)基因多樣度（Hs）、基因分化系數(shù)（G_st ）、基因流（N_m）和Nei′s遺傳距離（D）和遺傳一致度（I），并據(jù)此采用UPGMA聚類法建立系統(tǒng)聚類分支樹狀圖，分析各群體之間的遺傳關(guān)系。同時也通過Shannon′s居群分化系數(shù)[（ H_sp-H_pop）/H_sp]來估測居群間的遺傳變異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT多態(tài)性檢測 采用27個擴(kuò)增譜帶清晰并呈現(xiàn)多態(tài)性的引物對所有45份樣品進(jìn)行SCoT-PCR擴(kuò)增檢測。SCoT標(biāo)記的多態(tài)性見表2：每條引物產(chǎn)生5～25 條擴(kuò)增帶，27 條引物共得到350 條擴(kuò)增帶，其中有284條呈多態(tài)性，平均每個引物產(chǎn)生12.96 條擴(kuò)增帶和10.52條多態(tài)性帶。由此可見，SCoT標(biāo)記的多態(tài)效率檢測較高，適用于桃兒七的遺傳多樣性分析。

2.2 遺傳多樣性分析 通過POPGEN_E軟件分析，得到桃兒七在物種和居群水平上的相關(guān)遺傳參數(shù)（表3）。在物種水平上，桃兒七的遺傳多樣性較為豐富，PPB 79.27%，N_e 1.332 7，H 0.210 9，H_sp0.328 6。在居群水平上，6 個居群的遺傳多樣性均較低，高低排序依次為POP3>POP5>POP2>POP4>POP1>POP6，各群體遺傳參數(shù)的平均值和變化范圍為 PPB 10.48%（4.00%～23.71%），N_e=1.048 7（1.020 7～1.103 7），H=0.029 7（0.012 9～0.063 1），Hpop 0.046 2（0.019 9～0.098 6），表明群體間的遺傳多樣性存在差異，尤其是POP3與其他居群存在較為顯著的差異， POP6居群的遺傳多樣性最低可能與該居群采集的個體較少有關(guān)（僅4個）。

2.3 桃兒七6個居群的遺傳結(jié)構(gòu)分析 居群的遺傳結(jié)構(gòu)分析包括總的基因多樣度（Ht）、居群內(nèi)基因多樣度（Hs）、居群間的基因多樣度（D_st=Ht-Hs）、基因分化系數(shù)（G_st）和基因流（N_m）等指標(biāo)。

用Nei′s基因多樣度衡量，6 個居群Ht 0.186 9，其中Hs 0.029 7，D_st0.157 2。Nei′s的基因分化系數(shù)G_st 0.841 1，表明有84.11%的遺傳變異存在于居群間，15.89%的遺傳變異存在于居群內(nèi)，居群間的遺傳分化遠(yuǎn)大于居群內(nèi)的分化，說明群體間變異是桃兒七的主要變異來源。

用Shannon′s多樣性信息指數(shù)衡量，物種水平上Shannon′s多樣性信息指數(shù)H_sp0.328 6，居群水平上H_pop 0.046 2（表4），計算出Shannon′s居群分化系數(shù)（H_sp-H_pop）/H_sp為0.849 4，即有84.94% 的遺傳變異分布在居群間，14.06%的遺傳變異分布在居群內(nèi)部。以上2 種方法的分析結(jié)果完全一致，共同表明桃兒七不同居群間的遺傳分化明顯，遺傳變異主要存在于居群間。

桃兒七居群間基因流[N_m=0.5（1-G_st ）/G_st]為0.094 4，小于1，表明桃兒七居群間基因交流處于低等水平，交流比較少，遺傳分化程度較高。

2.4 遺傳距離與聚類分析 用POPGEN_E計算出了桃兒七6個野生居群間的Nei′s遺傳一致度（I）為0.570 8～0.978 7，遺傳距離為0.021 6～0.560 7（表4）。POP1與POP3之間的遺傳一致度最低（I 0.570 8），遺傳距離最遠(yuǎn)（D 0.560 7），表明親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。POP5與POP6之間的遺傳一致度最高（I 0.978 7），遺傳距離最近（D 0.021 6） ，表明親緣關(guān)系最近。

MEGA5基于Nei′s遺傳距離繪出的UPGMA聚類分支樹狀圖（圖1）表明，6個群體聚為2 類：POP3獨(dú)為第Ⅰ類，其余5居群聚為第Ⅱ類。在第Ⅱ類中，來源于西藏的2個居群（POP1與POP2）聚為一支，來源于四川2個居群（POP4與POP6）與青海的1個居群（POP6）聚為一支。從供試材料間的聚類結(jié)果可以看出，地理來源相同或相近的種質(zhì)趨向于聚在一類，但也有例外，如POP3獨(dú)為一支，與各居群的遺傳差異較大。

3 討論

3.1 桃兒七遺傳多樣性的比較 桃兒七雖然為瀕危物種，供試材料中桃兒七野生居群在物種水平上具有較豐富的遺傳多樣性 （PPB 79.27%）。但在居群水平上其遺傳多樣性卻較低，平均僅為10.48%，且不同居群之間PPB變化幅度較大，其中青海玉樹與其他居群表現(xiàn)出明顯的遺傳差異，PPB高達(dá)23.71%。如果將這一居群排除在外，僅用其他5個居群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)物種水平上PPB為54.14%，由此可見桃兒七居群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)研究中，群體的選擇非常重要。本研究與已有文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果表明，由于檢測手段和研究群體各異，在揭示桃兒七居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)狀況差異也是較大的（表5）。本研究的結(jié)果與吳剛[16]等的結(jié)果較為一致，與肖猛[14]的研究差異較大。盡管不同研究者所得出的結(jié)果存在差別，通過有效和準(zhǔn)確地分析和利用這些遺傳數(shù)據(jù)，還是可以看出相同的趨勢：桃兒七野生居群間基因交流處于低等水平，遺傳分化明顯，遺傳變異主要存在于居群間。同時也可以看到肖猛[14]采用不同的分子標(biāo)記（RAPD，ISSR，AFLP）對相同的研究材料（四川西部的桃兒七7 個自然居群）的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，3種標(biāo)記方法得到的結(jié)果具有較高的一致性，從分子水平上基本了解了四川西部高原地區(qū)桃兒七的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)狀況。

由于所選分子標(biāo)記自身的特點(diǎn)和研究材料的局限性，要全面的評價桃兒七的群體遺傳變異，還需要進(jìn)一步全面收集種源，采用有效的分子標(biāo)記對桃兒七遺傳多樣性的變異大小、時空分布等從遺傳學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)行系統(tǒng)的剖析，才能真正揭示該物種的進(jìn)化歷史，深入分析其瀕危原因和進(jìn)化潛力，為科學(xué)合理地制訂保護(hù)策略提供理論支持。

3.2 基因流障礙 供試材料居群間基因流為0.094 4，處于極低水平，說明存在明顯的基因流障礙。植物種群內(nèi)和種群間的基因流是借助于花粉、種子、孢子、營養(yǎng)體等遺傳物質(zhì)攜帶者媒介來實(shí)現(xiàn)的，其中花粉和種子的擴(kuò)散是2種最主要的形式。就桃兒七而言，基因流障礙與其特有的繁育系統(tǒng)、種子的有限傳播方式以及地理隔離效應(yīng)有關(guān)。

花粉基因流的強(qiáng)弱和植物的繁育系統(tǒng)有很大關(guān)系。桃兒七是一種自交或自交占優(yōu)勢的植物[10]，基因流動無法通過傳粉的方式來實(shí)現(xiàn)， 大大限制了該物種的基因流。因此， 桃兒七分布區(qū)的擴(kuò)張與群體間的基因流動主要通過種子傳播來進(jìn)行。成熟的桃兒七果實(shí)中雖然具有較多的種子（平均60粒左右），繁殖系數(shù)較高，但種子具有休眠特性，且自然狀態(tài)下萌發(fā)率低，降低了因種子傳播而產(chǎn)生的基因流。筆者等在野外調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，同一居群中桃兒七常見有叢生狀態(tài)（同一果實(shí)的種子萌發(fā)形成的多個個體形成叢生），證實(shí)自然狀態(tài)下，桃兒七種子的傳播方式主要是依靠重力和果實(shí)破裂方式進(jìn)行的，傳播的距離相當(dāng)有限。此外，桃兒七種子的另一種傳播途徑是依賴人或動物來進(jìn)行。在進(jìn)化過程中，桃兒七為有效的傳播種子，形成了一些適應(yīng)機(jī)制：成熟的桃兒七果實(shí)不含鬼臼毒素，富含糖分，味甜，且果實(shí)顏色鮮艷，能吸引人和其他動物食用，為其傳播種子[13]，但這種傳播方式具有極大的隨機(jī)性。肖猛[14]發(fā)現(xiàn)偶爾其種子由牲畜短距離在同居群內(nèi)擴(kuò)散，極少情形下因鳥類或人為活動在居群內(nèi)或居群間傳播。由此可見，種子的有限傳播也是造成由桃兒七有限基因流的原因之一。

有限的基因流還可能與種群的空間地理隔離效應(yīng)有關(guān)。桃兒七分布區(qū)域雖大，野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)桃兒七居群的生境片斷化趨勢明顯，大多居群呈星散島狀分布，彼此隔離，有時一條小河或山谷就成為一個明顯的分界線，分布于同一山谷的個體就組成了1個有效居群[16]。且多數(shù)居群規(guī)模很小，限制了群體間的基因流，產(chǎn)生了明顯的遺傳漂變。

3.3 桃兒七遺傳多樣性的保護(hù)策略 種質(zhì)資源的分子評價是對物種進(jìn)行保護(hù)、合理利用和遺傳改良的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明桃兒七具有較豐富的遺傳多樣性，為有效保護(hù)和改良種質(zhì)資源奠定了一定的基礎(chǔ)。根據(jù)桃兒七群體遺傳變異特點(diǎn)，提出了桃兒七遺傳多樣性的保護(hù)策略就地保護(hù)，重點(diǎn)保護(hù)遺傳多樣性高的群體。雜交育種中進(jìn)行親本選配時，種群選擇是提高育種效率的重要途徑之一，因此，除了對所有種群進(jìn)行必要的保護(hù)外，應(yīng)重點(diǎn)保護(hù)遺傳多樣性高的地區(qū)，如本研究中的青海玉樹居群蘊(yùn)藏著桃兒七豐富的遺傳資源；遷地保護(hù)，注重取樣策略，即在盡可能多的群體中取樣。由于桃兒七群體間遺傳變異均存在顯著的分化，且主要來源于居群間，因此，在遷地保護(hù)時應(yīng)盡可能在較多的群體中取樣，而不是在同一群體取多個個體；野生撫育，人為增加基因流動。采用模擬原生態(tài)環(huán)境的種植方式，通過人工散播種子提高群體間的基因交流，以達(dá)到盡可能最大限度的保護(hù)和豐富其遺傳多樣性的目的。

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Genetic diversity and genetic structure of endangered wild Sinopodophyllum

emodi by start codon targeted polymorphism

CHEN Da-xia1， ZHAO Ji-feng1， LIU Xiang1， WANG Chang-hua1， ZHANG Zhi-wei1， Qin Song-yun1， ZHONG Guo-yue2*

（1.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， National Engineering Laboratory for

Propagation of Endangered Traditional Chinese Medicine， Chongqing 400065， China；

2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

[Abstract] Objective： Revealed the genetic diversity level and genetic structure characteristics in Sinopodophyllum emodi， a rare and endangered species in China.Method： We detected the genetic polymorphism within and among six wild populations （45 individuals） by the approach of Start Codon Targeted （SCoT） Polymorphism.The associated genetic parameters were calculated by POPGENE1.31 and the relationship was constructed based on UPGMA method.Result： A total of 350 bands were scored by 27 primers and 284 bands of them were polymorphic.The average polymorphic bands of each primer were 10.52.At species level， there was a high level of genetic diversity among six populations （PPB=79.27%， Ne=1.332 7， H=0.210 9 and H_sp=0.328 6）.At population level， the genetic diversity level was low（PPB=10.48%（4.00%-23.71%）， N_e=1.048 7（1.020 7-1.103 7）， H=0.029 7（0.012 9-0.063 1）， H_pop=0.046 2（0.019 9-0.098 6）.The Nei′s coefficient of genetic differentiation was 0.841 1， which was consistent with the Shannon′s coefficient of genetic differentiation （0.849 4）.Two calculated methods all showed that most of the genetic variation existed among populations.The gene flow （N_m=0.094 4） was less among populations， indicating that the degree of genetic differentiation was higher.Genetic similarity coefficient were changed from 0.570 8 to 0.978 7.By clustering analysis， the tested populations were divided into two classes and had a tendency that the same geographical origin or material of similar habitats clustered into one group.Conclusion： The genetic diversity of samples of S.emodi is high，which laid a certain foundation for effective protection and improvement of germplasm resources.

[Key words] Sinopodophyllum emodi； SCoT； genetic diversity； genetic structure

doi：10.4268/cjcmm20130227

[責(zé)任編輯 呂冬梅]