景雁鳳，劉志敏，趙振江，鄭瑩瑩，展海軍

（河南工業(yè)大學 化學化工學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

辛硫磷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛的一種有機磷農(nóng)藥，它可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，導致體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的大量蓄積，從而產(chǎn)生惡心、頭疼等中毒癥狀，嚴重的可以導致死亡[1]，因此對其快速檢測顯得非常重要.傳統(tǒng)的檢測方法主要是色譜法，但這些方法樣品處理復雜，不適于進行現(xiàn)場檢測[2].基于電化學方法的傳感器，由于儀器易于微型化，為實現(xiàn)現(xiàn)場檢測分析提供了可能.

石墨烯是由單層碳原子密集排列成的二維蜂窩晶格結構的一種碳材料，具有導電性能好、比表面積大和電子轉(zhuǎn)移速率快等優(yōu)點，目前已用作制備電化學傳感器的電極材料[3-5].但石墨烯的團聚限制了它的廣泛應用.研究表明，石墨烯-氧化物復合材料具有良好的分散性和穩(wěn)定性[6]，這些特性使其有望用于電化學傳感器的構建并用于實際測定研究.基于此，本文構建了一種基于石墨烯-ZnO（GR-ZnO）復合物的乙酰膽堿酯酶生物傳感器，并用于快速靈敏的檢測辛硫磷農(nóng)藥.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Prestige-21 傅立葉變換紅外光譜儀：日本島津公司；Hitachi-800 透射電子顯微鏡：日本日立公司；X－射線粉末衍射儀：XRD，D/max 2550，日本理學公司；CHI650C 電化學工作站：上海辰華儀器有限公司.采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE，Φ=3 mm）及復合物修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑絲電極為對電極.

氯化乙酰膽堿（ATCl）和乙酰膽堿酯酶（AChE，C3389，236 U/mg）購于Sigma 公司；辛硫磷（純度≥99.99%）購自北京上立方聯(lián)合化工技術研究院；戊二醛（25%）由上海國藥集團提供；其他試劑均為分析純.試驗用水為二次蒸餾水.

1.2 GR-ZnO 復合物的制備

首先采取文獻［7］中方法合成石墨氧化物（GO）和石墨烯（GR）.

GR-ZnO 復合物采用改進的文獻方法合成[8].在200 mL 蒸餾水中首先加入0.2 g GO，超聲2 h，然后與100 mL 含有0.2 g Zn（NO3）2的溶液混合均勻，之后加入3 mL 氨水和0.2 mL 水合肼，120 ℃反應4 h.產(chǎn)物用蒸餾水洗至中性，60 ℃干燥12 h，即制得GR-ZnO 復合物.

1.3 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備

殼聚糖（CHI）首先溶解在1%的冰醋酸中制得0.5%g/mL 殼聚糖分散液.然后將適量GR-ZnO 復合物加入到上述分散液中，超聲分散后得到GRZnO/CHI 分散液.

GR-ZnO/CHI 分散液與0.5%戊二醛等體積混合，之后取5 μL 溶液滴加至電極表面，晾干后再滴加5 μL 的乙酰膽堿酯酶溶液，冰箱中干燥即得乙酰膽堿酶生物傳感器（AChE/ZnO-GR/CHI/GCE）.

1.4 抑制率的計算方法

乙酰膽堿酯酶能夠催化底物氯化乙酰膽堿水解，催化活性受有機磷農(nóng)藥的抑制，導致水解產(chǎn)物硫代膽堿濃度減小，故電流減小.農(nóng)藥的濃度越大，電流減小的越顯著，即對酶的抑制率增加.抑制率可由下式計算[9]：

式中:I0為ATCl 在AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的響應電流；I1是辛硫磷抑制后ATCl 在AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的響應電流.

2 結果與討論

2.1 譜學表征

2.1.1 GR 的透射電鏡表征

采用透射電鏡研究了合成GR 的表面形貌，如圖1 所示，石墨烯呈現(xiàn)透明的，有小褶皺的薄片狀.

圖1 石墨烯的透射電鏡圖

2.1.2 GO、GR 和GR-ZnO 復合物的紅外光譜表征

圖2 中（a）為GO 的紅外圖譜，其中1 725 cm-1處的吸收峰為C＝O 的伸縮振動吸收峰，1 389 cm-1對應于C—O—H 的變形振動峰，1 063 cm-1處歸屬于C—O—C 伸縮振動吸收峰.GO 被水合肼還原后的紅外圖譜如圖2 中（b）所示，含氧官能團的吸收峰大大降低，說明GO 還原為GR 后，含氧基團基本上已被脫去.圖2 中（c）為GR-ZnO 復合物的紅外圖譜，與圖2 中（b）相比較，新增加的432 cm-1吸收峰為Zn-O 振動吸收峰[10].

圖2 GO（a）、GR（b）和GR-ZnO（c）復合物的紅外圖譜

2.1.3 GR 及GR-ZnO 的粉末衍射圖譜

GR，ZnO and GR-ZnO 的粉末衍射圖譜如圖3所示.GR 在25° 和44°出現(xiàn)衍射峰，與文獻報道一致[11].GR-ZnO 復合物的主要衍射峰與純ZnO 的衍射峰相同（JCPDS，65-3411），說明GR 的存在并沒有改變ZnO 的晶型.

圖3 GR，ZnO and GR-ZnO 的粉末衍射圖譜

2.2 修飾電極的電化學表征

2.2.1 不同電極的循環(huán)伏安圖

不同電極在5.0 mmol/L K3Fe（CN）6（含有0.1 mol/L KCl）溶液中的循環(huán)伏安曲線如圖4 所示.與裸玻碳電極（曲線a）相比，CHI 修飾后的電極峰電流（曲線b）稍增大，主要因為殼聚糖的導電性較差，使用GR-CHI 修飾電極后，峰電流增大（曲線c），這歸因于石墨烯較大的比表面積和良好的導電性.使用ZnO-GR/CHI 復合物修飾電極后，峰電流繼續(xù)增大（曲線d），這主要是由于石墨烯和氧化鋅的協(xié)同效應引起的.由于石墨烯非凡的電子傳遞性，改善了電極的導電性，加快了電極上電子的交換速度，而且高導電率的氧化鋅的存在又能使石墨烯的分散性得到極大提高.

圖4 不同電極在5.0 mmol/L K3Fe（CN）（6含有0.1 mol/L KCl）溶液中的循環(huán)伏安圖

2.2.2 AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的電化學行為

圖5 為不同修飾電極在含有1.0 mmol/L ATCl的PBS（pH 7.5）中的循環(huán)伏安圖，可以看出，裸GCE 電極沒有峰（曲線a）；而修飾電極AChE-CHI/GCE 有微弱的峰出現(xiàn)（曲線b），這個峰是AChE 催化底物ATCl 的水解產(chǎn)物巰基膽堿產(chǎn)生的氧化峰；電極經(jīng)過GR 修飾后，峰電流增加（曲線c），而經(jīng)過復合材料（ZnO-GR）修飾后的電極，其峰電流顯著增加，說明納米級氧化鋅和GR 具有較高的比表面積和電催化作用使基底和電極表面的電子轉(zhuǎn)移速度加快.同時也說明GR 和納米氧化鋅復合物具有很好的協(xié)同作用.

圖5 不同電極在pH 7.5 PBS 中含1.0 mmol/L的ATCl 的循環(huán)伏安圖

2.3 試驗條件的優(yōu)化

2.3.1 pH 的優(yōu)化

溶液的pH 值決定固定AChE 的生物活性，圖6 顯示了pH 值對1.0 mmol/L ATCl 在AChE/ZnOGR/CHI/GCE 上響應電流的影響.可以看出，在pH 7.5 時峰電流值最大.考慮到檢測農(nóng)藥的靈敏度，本試驗選擇pH 值為7.5.

圖6 緩沖溶液的pH 對峰電流的影響

2.3.3 AChE 用量的優(yōu)化

酶的固定量影響生物傳感器的響應信號.試驗在含有1.0 mmol/L ATCl（pH 7.5 PBS）中考察了固定不同量的酶對響應信號的影響.如圖7 所示，當酶固定量達到50 U 時，響應電流值達到最大，進一步增加酶用量峰電流卻減小.因此，試驗選擇酶的固定量為50 U.

圖7 酶濃度對傳感器響應的影響

2.3.5 抑制時間的選擇

在農(nóng)藥分析中抑制時間是最有影響力的參數(shù)之一，圖8 顯示了抑制時間對生物傳感器響應的影響.很顯然，隨著在辛硫磷溶液中抑制時間的增加，ATCl 在傳感器上的響應電流逐漸減小.當抑制時間大于11 min，響應電流值趨向一個穩(wěn)定值，表明辛硫磷和AChE 之間的結合位點達到平衡.因此抑制時間為11 min，從而使抑制率最大.

圖8 農(nóng)藥的抑制率與抑制時間的關系

2.4 辛硫磷的檢測

在優(yōu)化的試驗條件下，AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 在不同濃度的辛硫磷溶液中的差分脈沖伏安圖如圖9 所示.由圖9 可看出，隨著辛硫磷濃度的增加，電流逐漸減小，響應電流的減少值與辛硫磷的濃度成正比關系，這樣就得到了用于分析的工作曲線.如圖10 所示，抑制率與辛硫磷濃度的對數(shù)值在1.0×10-11mol/L～1.0×10-6mol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性方程為：A（%）=109.56+8.66 lgc，相關系數(shù)為0.988 0，檢出限為3.4×10-12mol/L（S/N=3）.

圖9 傳感器在不同濃度辛硫磷溶液中的差分脈沖伏安圖

2.5 實際樣品檢測

稱取10 g 新鮮白菜菜葉，用研缽研碎，然后置于表面皿中，用微量注射器吸取100 μL 10-5mol/L辛硫磷農(nóng)藥標準溶液，將其噴撒于菜葉上，加蓋放置10 h，然后用丙酮萃取樣品中的辛硫磷，過濾并轉(zhuǎn)移至50 mL 的容量瓶中，定容搖勻，得到樣品溶液.樣品溶液進行加標回收率試驗，回收率的范圍在91.0%～110.0%之間.結果表明本試驗所用的檢測方法具有很高的準確性，可以用于實際樣品的直接分析.

圖10 辛硫磷的工作曲線圖

3 結論

本文中提出了一種基于石墨烯-氧化鋅復合物固定乙酰膽堿酯酶的新型生物傳感器（AChE/ZnO-GR/CHI/GCE），并將其用于農(nóng)藥辛硫磷的測定.采用循環(huán)伏安法對不同修飾電極的電化學行為進行了表征，結果表明ZnO-GR/CHI 復合膜修飾于碳玻電極表面，能有效地提高玻碳電極的電化學響應能力及保持乙酰膽堿酯酶的生物活性.由于乙酰膽堿酯酶能催化底物氯化乙酰膽堿的水解，水解產(chǎn)物巰基膽堿在電極上發(fā)生氧化產(chǎn)生電流，農(nóng)藥的加入會使該電流減小，產(chǎn)生抑制作用，抑制率與加入農(nóng)藥濃度的對數(shù)在一定范圍內(nèi)有良好的線性關系，據(jù)此建立了測定辛硫磷的新方法.

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