Wnt信號通路分子在大鼠神經(jīng)干細胞分化過程中的表達

張 建，顧 茵，羅學(xué)勝，陳 穗，楊 忠，李紅麗，蔡文琴

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Wnt信號通路分子在大鼠神經(jīng)干細胞分化過程中的表達

張 建1，顧 茵1，羅學(xué)勝1，陳 穗1，楊 忠2*，李紅麗2，蔡文琴2

（1解放軍第113醫(yī)院干部病房，寧波 315040；2解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，重慶 400038）

觀察Wnt信號通路主要分子[β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）]在神經(jīng)干細胞（NSCs）體系的表達及其在增殖和分化過程中的變化，探討其在神經(jīng)干細胞分化中可能的調(diào)控作用。采用原代培養(yǎng)方法，自14～16d大鼠胚胎大腦皮后獲得含大量細胞團的NSCs體系。應(yīng)用含10%胎牛血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)NSCs分化。Western印跡檢測NSCs在加入胎牛血清12，24，48和72h后，β-catenin與GSK-3β在分化過程中的動態(tài)變化。免疫細胞化學(xué)染色顯示NSCs細胞團及散在的單個細胞多呈巢蛋白（nestin）陽性，顯示NSCs分化過程中兩者存在持續(xù)表達，β-catenin分子表達呈現(xiàn)逐漸減少趨勢，而GSK-3β分子表達則呈現(xiàn)逐漸增加趨勢。提示W(wǎng)nt信號通路與NSCs的增殖和分化過程密切相關(guān)，呈現(xiàn)出由活躍到逐步抑制的過程，為研究Wnt信號通路參與NSCs增殖分化調(diào)控的機制提供了載體。

Wnt信號通路；β-連環(huán)蛋白；糖原合酶激酶-3β；神經(jīng)干細胞；免疫細胞化學(xué)

Wnt信號通路是細胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是經(jīng)典Wnt信號通路主要的胞漿內(nèi)效應(yīng)分子，糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）主要作用是使游離的β-catenin磷酸化[1]。該通路廣泛參與了包括細胞增殖、細胞命運特化、細胞極性及細胞遷移等生物學(xué)過程，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中有著重要作用[2]。神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）作為神經(jīng)系統(tǒng)組織細胞的前體，有關(guān)其增殖分化過程分子機制的研究是近年神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點[3]。目前對Wnt信號通路在NSCs增殖、分化與細胞命運決定等過程中的作用，文獻報道存在較大差異。在哺乳類神經(jīng)系統(tǒng)，幾年來Wnt信號通路對神經(jīng)管和神經(jīng)嵴細胞增殖、凋亡及命運決定的調(diào)控作用逐步受到關(guān)注[4]，如早期對神經(jīng)管及神經(jīng)嵴等的研究中提示W(wǎng)nt信號分子能促進神經(jīng)前體細胞的增殖與發(fā)生[5]。本研究旨在探討Wnt信號通路分子在NSCs的增殖、分化和命運決定中究竟發(fā)揮何種作用，它們在不同發(fā)育階段或不同的前體細胞類型中是否存在差異。此方面的研究不僅有助于闡明NSCs的增殖分化機制，還將有可能為維持NSCs原始增殖狀態(tài)、阻止其分化提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用孕13～16d Wistar大鼠共18只，平均體質(zhì)量（350±20）g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器

β-catenin和GSK-3β多克隆抗體（兔血清）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，巢蛋白（nestin），膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），神經(jīng)絲（neurofilament）和微管相關(guān)蛋白（microtubule associated protein，MAP）一抗為美國Sigma公司生產(chǎn)的小鼠血清來源的單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，購自武漢博士德公司，蛋白裂解液（RIPA，PMSF）購自上海申能博彩生物科技公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自于美國Gibco公司，優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自于奧地利PAA公司，胰蛋白酶購自于美國Sigma公司。解剖顯微鏡為德國Leica儀器公司產(chǎn)品；高速臺式離心機為Sartorius 1-15 Sigma，德國；液氮貯存罐為YDS-30-125，四川亞西機械廠；紫外分光光度儀為U-1800 HITACHI，日本；5%CO237℃培養(yǎng)孵箱為SeriesⅡ 3111型，美國；超凈工作臺為Air Tech HS-1300-V，中國蘇州；凝膠成像分析系統(tǒng)為SK 300，上海生物技術(shù)公司；數(shù)碼攝像系統(tǒng)為OLYMPUS DP70，倒置相差顯微鏡為OLYMPUS IX51，倒置相差熒光顯微鏡為OLYMPUS IX70，均日本。

1.3 大鼠胚胎大腦皮層NSCs的分離培養(yǎng)

（1）取孕13～16d Wistar大鼠1只，1%的戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉后，碘酊和乙醇消毒腹部皮膚；（2）在準備室內(nèi)用無菌手術(shù)剪依次剪開下腹部皮膚、肌肉和腹膜，暴露兩側(cè)子宮，順子宮分離至子宮角處剪下，放入培養(yǎng)皿中，D-Hanks液中漂洗；（3）依次去掉子宮壁及胎膜，取胎鼠于75%的乙醇中浸泡進行皮膚消毒；（4）用眼科剪剪開頭皮和顱骨，剝離暴露出胎鼠大腦，取皮質(zhì)組織；（5）在解剖顯微鏡下，去除腦膜，剪成約1.5mm×2.0mm×1.0mm大小的組織塊，置于D-Hanks液中直接吹打成單細胞懸液，種植入50ml培養(yǎng)瓶中，每瓶細胞數(shù)約為1×106個。培養(yǎng)條件：DMEM/F12＋20ml/L 50×B27＋20ml/L bFGF，37℃，5%CO2。待原代神經(jīng)細胞球（neurosphere）形成較多時（約4～5d）進行傳代。本實驗中主要使用第3代和第4代細胞，巢蛋白免疫熒光染色鑒定NSCs性狀。同時用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F12培養(yǎng)液對NSCs進行誘導(dǎo)分化，后分別以神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的特異標志物神經(jīng)絲及GFAP抗體鑒定其多向分化潛能。

1.4 NSCs的傳代培養(yǎng)

將培養(yǎng)的細胞集落收集入離心管中，800～1000r/min離心2～5min，棄上清液，加入少量條件培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打細胞集落，盡量使其分散，計數(shù)細胞后（2×106個細胞/瓶）置入50ml培養(yǎng)瓶中，加NSCs條件培養(yǎng)液6～7ml，置37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，依據(jù)細胞生長快慢進行傳代。在傳代過程中，盡量吹散，但也不能過猛，以免影響其克隆的生長。

1.5 NSCs免疫細胞化學(xué)鑒定

（1）將培養(yǎng)的干細胞團用4%多聚甲醛固定30min后涂在載玻片上，在37℃孵箱中烘干；（2）0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）漂洗5min×3次，0.3%TritonX-100，室溫20min，兔抗巢蛋白IgG，37℃孵育，1h后轉(zhuǎn)入4℃過夜；（3）0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，F(xiàn)ITC-抗兔IgG，37℃，2h；（4）0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，漂洗后甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。陰性對照：用0.01mol/L PBS或與二抗同種動物血清代替一抗進行，其他步驟不變。

1.6 NSCs的分化

（1）設(shè)立NSCs對照組，同時在NSCs培養(yǎng)瓶中加入含10%FBS清誘導(dǎo)其分化，觀察干細胞的變化；（2）分別于分化12，24，48和72h終止培養(yǎng)，通過相差顯微鏡觀察NSCs在分化過程中的形態(tài)變化，同時成像；（3）收集NSCs以及誘導(dǎo)分化后12，24，48和72h一共5個時相點的細胞，先將培養(yǎng)的細胞收集入離心管中，800～1000r/min離心2～5min，棄上清液；（4）再將收集了細胞的EP管置于液氮中冷凍5～10min；最后將細胞收集于1.5ml離心管（即EP管），置-80℃冰箱中冷凍保存，用于Western blotting實驗中提取細胞蛋白。

1.7 Western blotting

（1）快速取所需組織，液氮冷凍、研缽粉碎，加入苯甲磺酰氟（PMSF，每克組織30μl），冰上孵育30min；（2）移入離心管，4℃離心（150×）15min，取上清；（3）將0.5g/L標準蛋白溶液稀釋為6個濃度，以蛋白濃度為橫坐標,以吸光度值為縱坐標作曲線；（4）考馬斯亮藍染色測定蛋白濃度，取待測樣品進行檢測，根據(jù)其吸光度值計算蛋白濃度；（5）用圖像分析軟件對掃描結(jié)果進行分析，得到平均吸光度值。（6）每個樣品取10μl蛋白質(zhì)加入10μl上樣緩沖液，100℃一起煮沸5min，進行定性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；（7）然后移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液沖洗，4℃孵育過夜；（8）PVDF膜在室溫下與β-catenin抗體（1∶2000）孵育1h，漂洗后入生物素化二抗（1∶2000）室溫下孵育1h，每次孵育之間均用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min；（9）二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，掃描記錄。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包。計量資料的比較采用檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCs的培養(yǎng)和鑒定

原代培養(yǎng)細胞在無血清的NSCs培養(yǎng)液中2～3d內(nèi)部分死亡，其余大部分逐步分裂形成多細胞的細胞團，繼續(xù)培養(yǎng)后細胞生長旺盛，細胞團數(shù)目迅速增多增大，成懸浮球團狀生長，無突起?？寺鞔囵B(yǎng)后也形成類似于原代的細胞團（圖1）。免疫細胞化學(xué)染色顯示細胞團及散在的單個細胞多呈巢蛋白陽性（圖2）。血清誘導(dǎo)分化后NSCs團在12h內(nèi)即貼壁并開始發(fā)出突起，隨后有細胞向外遷移，2～3d內(nèi)細胞突起即非常明顯，彼此連接形成網(wǎng)絡(luò)，越往后細胞分散越為明顯（圖3）。分化的細胞形態(tài)多樣，通過細胞特異性抗原的免疫熒光鑒定，部分細胞呈現(xiàn)GFAP陽性，為星形膠質(zhì)細胞，部分呈現(xiàn)MAP2陽性，為神經(jīng)元。提示所得細胞為具有良好增殖能力和多向分化潛能的NSCs體系（圖4）。

分化后細胞大致有3種類型：（1）具有數(shù)個粗大突起的星形膠質(zhì)細胞樣細胞，胞體較寬大，折光性弱；（2）具有1～2個突起，胞體呈圓形或橢圓形的神經(jīng)元樣細胞，細胞較小，突起短而少，細胞分散排列，折光性強；（3）具有多個細長突起的少突膠質(zhì)細胞樣細胞，細胞大小介于前二者之間。

2.2 NSCs分化過程中Wnt信號分子表達的動態(tài)變化

Western blotting結(jié)果顯示，在NSCs血清誘導(dǎo)分化12，24，48和72h各組中均存在著β-catenin和GSK-3β的持續(xù)表達，隨著NSCs分化時間的延長，β-catenin平均吸光度值呈現(xiàn)梯度減少，表示β-catenin量呈現(xiàn)梯度下降（＜0.05；圖5）。從NSCs對照組開始，隨著NSCs分化時間的延長，GSK-3β蛋白平均吸光度值呈現(xiàn)梯度增加，表示GSK-3β量呈現(xiàn)梯度增加（＜0.05；圖6）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理顯示各組之間存在明顯差異。實驗結(jié)果表明：NSCs在加入10%FBS以后，伴隨NSCs的分化時間逐漸延長，β-catenin在NSCs分化細胞中的表達呈現(xiàn)梯度減少，而GSK-3β在NSCs分化細胞中的表達呈現(xiàn)梯度增加。圖7為β-catenin與GSK-3β兩類分子動態(tài)變化趨勢圖。

圖1 培養(yǎng)3d懸浮生長的NSCs

Figure 1 Neural stem cells cultured for 3 days (×200)

圖2 NSCs的鑒定

Figure 2 Identification of neural stem cells by immunofluorescence technique using anti-Nestin (FITC×200)

圖3 FBS誘導(dǎo)分化2d的NSCs

Figure 3 Neural stem cells differentiated for 2 days using 10% fetal bovine serum (×200)

圖4 誘導(dǎo)分化7d的NSCs的雙標鑒定(Anti-MAP2 FITC/ Anti-GFAP Cy3)

Figure 4 Double staining identification of neural stem cells after differentiation for 7 days using anti-MAP2 and anti-GFAP (FITC×200)

圖5 加入10%胎牛血清后NSCs分化過程β-catenin的Western blotting分析

Figure 5 Western blotting analysis of dynamic changes of β-catenin in the differentiation of neural stem cells cultured in media containing 10% fetal bovine serum Along with the extension of the time of differentiation, the level of β-catenin decreases gradually

圖6 加入10%胎牛血清后NSCs分化過程GSK-3β的Western blotting分析

Figure 6 Western blotting analysis of dynamic changes of GSK-3β in the differentiation of NSCs cultured in media containing 10% FBS Along with the extension of the time of differentiation, the level of GSK-3β increases gradually

圖7 NSCs誘導(dǎo)分化過程中不同時相點GSK-3β與β-catenin的表達

Figure 7 Dynamic expression of β-catenin and GSK-3β during differentiation of cultured NSCs

3 討 論

近年來，對NSCs的研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點，尤其近年研究發(fā)現(xiàn)，NSCs不僅存在于胚胎神經(jīng)組織，同樣存在于成體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6]。人們希望通過闡明NSCs增殖分化的調(diào)控機制，使其定向神經(jīng)細胞分化，將有可能實現(xiàn)NSCs應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植或替代治療，以及發(fā)現(xiàn)調(diào)控神經(jīng)發(fā)生等的手段[7]，也有可能為部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病的治療帶來希望。目前在NSCs分化調(diào)控機制的研究中已獲得一些重要線索，如發(fā)現(xiàn)Notch蛋白的主要作用為抑制干細胞的神經(jīng)元方向分化，而促進向膠質(zhì)細胞方向分化，bHLH基因家族對NSCs的作用與Notch蛋白正好相反[8]。我們在實驗中從胎大鼠大腦皮質(zhì)獲得了NSCs，另外使用神經(jīng)上皮細胞的特異性抗原巢蛋白的抗體來證明我們所分離的細胞為胚胎早期細胞。在利用10%FBS誘導(dǎo)以后，再使用星形膠質(zhì)細胞的特異性抗體GFAP和神經(jīng)元細胞的特異性抗體即MAP2，來證明所獲得的細胞群可以分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞等多種神經(jīng)系統(tǒng)的細胞。因此，本實驗中分離的細胞群具有良好的增殖能力和多項分化的潛能，具備了NSCs的基本屬性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞，為NSCs的定向分化提供了基礎(chǔ)的實驗資料。

目前，盡管關(guān)于Wnt蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育包括神經(jīng)前體細胞增殖分化中的調(diào)控作用已有一系列的文獻報道，但有關(guān)Wnt信號通路下游分子β-catenin和GSK-3β等在NSCs增殖、分化與細胞命運決定等過程中的作用，文獻報道存在較大差異。如有基于Wnt信號分子基因敲除的實驗觀察中顯示，Wnt通路的激活即β-catenin信號分子的表達增強能促進NSCs的增殖并阻抑其分化[9]，而有在神經(jīng)嵴細胞及皮質(zhì)前體細胞的研究則認為Wnt信號分子主要是NSCs的一個分化誘導(dǎo)因子[10]。而在Holowacz等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，封閉了β-catenin基因的NSCs也保持著多向分化潛能，包括有能力可以克隆分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。這一研究結(jié)果卻表明，β-catenin對于NSCs的增殖和分化不是必須的，但是對于神經(jīng)前體細胞的黏附和存活是必須的。因此，在NSCs增殖和分化過程中，Wnt信號通路分子的表達和動態(tài)變化的研究非常有意義，在各種外源性因素和細胞因子的影響下，Wnt信號通路在NSCs的增殖和分化過程中，是部分參與、不參與或者是起決定性作用，對此值得進一步研究和探討。

為了更好地闡明Wnt信號通路中β-catenin和GSK-3β等調(diào)控分子在NSCs增殖分化過程中的作用，本實驗通過建立離體的NSCs培養(yǎng)體系，首先應(yīng)用含10%FBS培養(yǎng)液誘導(dǎo)NSCs分化，為探討NSCs增殖和分化的機制提供了穩(wěn)定的載體，其次觀察了NSCs血清誘導(dǎo)分化過程中主要Wnt信號分子的動態(tài)表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著NSCs分化的進行，β-catenin表達量逐漸減少，而GSK-3β蛋白表達量逐漸增加；顯示了一個Wnt信號通路由活化狀態(tài)逐步走向抑制的過程。也提示β-catenin，GSK-3β與NSCs增殖和分化存在著密切的關(guān)系，它們可能是胚胎發(fā)育過程中NSCs增殖與分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。有的研究顯示腦神經(jīng)營養(yǎng)因子對于離體的NSCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的作用，最可能就是通過激活Wnt信號通路[12]。巨細胞病毒的感染造成大鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的畸形，被證實顯著地抑制NSCs的增殖與分化，也是通過抑制Wnt信號通路的關(guān)鍵分子的表達來影響NSCs的分化[13]。這與我們的研究結(jié)果是相一致的，NSCs的分化可能受到眾多因素的影響，但是各種神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子、細胞黏附因子和外源性因素在NSCs分化過程中通過激活Wnt信號通路的關(guān)鍵點究竟在哪里還有待于進一步的觀察，它的下游調(diào)控機制依然沒有完全闡述。另外有必要在進一步干擾和封閉Wnt信號通路后，進行流式細胞儀監(jiān)測和計數(shù)以繼續(xù)觀察NSCs分化細胞數(shù)比例改變的情況，以進一步論證相關(guān)的研究結(jié)果。

Lie等[14]發(fā)現(xiàn)，成年海馬NSCs或者神經(jīng)前體細胞均表達Wnt蛋白的受體（Fz）和相關(guān)信號通路的調(diào)控分子，結(jié)合既往一系列研究，顯示NSCs具有接受Wnt信號分子調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)。血清誘導(dǎo)NSCs分化代表其逐步失去強大增殖能力與多向分化潛能，基因水平可理解為部分基因的特異性關(guān)閉，而另一些基因出現(xiàn)表達，β-catenin和GSK-3β在此分化過程的相反變化即符合這一原則。但血清誘導(dǎo)如何導(dǎo)致GSK-3β表達的上調(diào)，從而導(dǎo)致Wnt信號通路的主要胞漿內(nèi)效應(yīng)分子的抑制，是否也經(jīng)由Fz受體步驟，還有待研究?？傊?，結(jié)合其他的各項研究結(jié)果，雖然有的研究認為NSCs的增殖和分化可能是通過Notch通路、STAT3通路等信號通路在發(fā)揮調(diào)控作用，Wnt信號通路僅對于NSCs的黏附作用是必須的。但是，我們在研究中認為，Wnt信號通路分子一直調(diào)控NSCs的功能和發(fā)育，與NSCs的增殖和分化過程是密切相關(guān)的。如果能夠激活Wnt信號通路的活動，是否可以通過調(diào)控下游Wnt信號通路分子的表達來抑制神經(jīng)發(fā)生的過程，從而導(dǎo)致NSCs增殖的加強，還需要以后的研究加以驗證。

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（編輯: 金美娜, 王雪萍）

Expression profiles of Wnt signaling molecules in differentiation process of rat neural stem cells

ZHANG Jian1, GU Yin1, LUO Xue-Sheng1, CHEN Sui1, YANG Zhong2*, LI Hong-Li2, CAI Wen-Qin2

(1Department of Geriatrics, Chinese PLA Hospital No.113, Ningbo 315040, China;2Department of Histology and Embryology, College of Basic Medical Sciences, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

To determine the expression profiles of main molecules in Wnt signal pathway, β-catenin and glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), in the proliferation and differentiation process of neural stem cells (NSCs), and to investigate the possible regulating role of these molecules in the process.The NSCs were isolated and primarily cultured from rat fetus at an embryonic age of 14 to 16d according to reported methods. At 12 to 24h after cultured in the medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), the cells attached and grew gradually. Western blotting was used to measure the protein levels of β-catenin and GSK-3β in the cells treated in the FBS medium or control after 12, 24, 48 and 72 hours treatment.Immunofluorescence assay indicated that the cultured neurospheres or single cells were positive with nestin. Western blotting results revealed a continuous expression of β-catenin and GSK-3β in the differentiation of the cultured NSCs. β-catenin was in a gradual decreasing tendency, whereas GSK-3β showed an opposite change.Wnt signaling pathway is involved in the proliferation and differentiation of NSCs, and is active first and then gradually inhibited. These confirm the NSCs biological property of the culturing cells and provide a model for studying the role of Wnt signaling molecules.

Wnt signaling pathway; β-catenin; glycogen synthase kinase-3β; neural stem cells; immunocytochemistry

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R322.81

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00235

2013?07?30;

2013?08?28

第三軍醫(yī)大學(xué)回國人員啟動基金

楊 忠, E-mail: yangzhong1999@163.com