朱雄偉，張佑紅，徐智鵬，蘇騰甲，熊 瑤，翟莉莉

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074）

0 引 言

免疫學(xué)技術(shù)正沿著基礎(chǔ)研究－應(yīng)用研究－高技術(shù)開(kāi)發(fā)研究3條主線(xiàn)在開(kāi)展，三者互相促進(jìn)，推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展［1］．雜交瘤技術(shù)的建立和細(xì)胞因子對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)育、分化的發(fā)現(xiàn)，基因工程技術(shù)的發(fā)展，使實(shí)驗(yàn)室的研究直接轉(zhuǎn)向生物高技術(shù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，如重組細(xì)胞因子、單克隆抗體及其相應(yīng)的試劑盒、多克隆抗體、基因工程抗體和疫苗等已經(jīng)或正在投入臨床使用，特別是抗體藥物以其對(duì)人體無(wú)毒無(wú)副作用、完全天然和高度特異性的療效，越來(lái)越顯示其優(yōu)勢(shì)，并創(chuàng)造出巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益［2］．

1962年，Ashford等［3］報(bào)道在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞自噬現(xiàn)象，近年來(lái)由于發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的基因，以及自噬在生物體生理和病理等方面的作用，自噬基因融合蛋白（ATG12）是與自噬相關(guān)基因表達(dá)的蛋白．本研究合成帶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽ATG12融合蛋白來(lái)免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，并用免疫親和純化方法提純抗血清中的多克隆抗體、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)抗體效價(jià)、蛋白印跡（Western blotting）檢測(cè)抗體特異性及在組織中的表達(dá)情況、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）檢測(cè)其濃度．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 材 料

1．1．1 研究對(duì)象 新西蘭大白兔．

1．1．2 實(shí)驗(yàn)試劑 抗原；乙醇；20 mmol／L 磷酸緩沖溶液p H 7．2；福氏佐劑；GST透析液；His溶液；PBS溶液；couping buffer；p H 5．0的甘氨酸；p H 2．0的 HCl溶液；1 mol／L Tris封閉液；p H 5．0 HCl溶液；CBB 溶液；0．01 mol／L Tris p H 7．5中和液；甘油；防腐劑Na N3；HRP酶標(biāo)二抗；質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%SKL；beads；0．01 mol／L PBS（p H 7．3）；10% 分離膠；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 濃縮膠；G250考馬斯亮藍(lán)溶液；0．15 mol／L NaCl溶液；2×（5×）SDS上樣緩沖液；甲醇；電泳緩沖液；轉(zhuǎn)移緩沖液；10×麗春紅染液、封閉液；TBST；TBS；ECL顯影底物；顯影液；定影液；DAB溶液；化學(xué)發(fā)光試劑、HRP酶標(biāo)二抗；脫脂奶粉；1 mol／L的Na HCO3；TMB顯色液；所有試劑均為分析級(jí)．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 抗血清的制備 具體方法如下［4］：

a．新西蘭大白兔的免疫．免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0．1 mL左右．抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1／4左右．每2～3周加強(qiáng)免疫一次．加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑，首次免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0．5 m L，加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗．在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3 m L血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)．

b．抗血清的采集與保存．取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血．取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身．剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30 s后，耳血管擴(kuò)張、充血．用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開(kāi)動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40 m L．然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯．二星期后，可在另一耳放血．此法可反復(fù)多次放血．頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰臥，固定于兔臺(tái)，剪去頸部的毛，切開(kāi)皮膚，暴露頸動(dòng)脈，插管，放血．取收集的血液在37℃恒溫箱中放置30 min以防止激活補(bǔ)體系統(tǒng)，再將試管在4℃放置過(guò)夜使血液凝固．用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，于4℃下4 000 r／min離心10 min．在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝，可在－20℃保存數(shù)年．

1．2．2 抗體的純化 具體步驟如下［5］：

a．抗原柱子的制備．找到相應(yīng)的血清和抗原、抗原的透析（對(duì)非包涵體蛋白）、活化beads、抗原與beads連接、封閉beads．

b．抗血清的預(yù)處理．將解凍好的血清在3 600 r／min，條件下離心17 min；除去離心后浮在表面的脂肪，將血清轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的瓶子中備用，注意盡量不要將沉在管底的血細(xì)胞倒出；對(duì)免疫原是GST融合蛋白的血清，同時(shí)是純化抗原也是GST融合蛋白，此時(shí)需過(guò)GST柱子，吸附掉anti－GST的抗體．注意此時(shí)要留抗原小樣，做ELISA檢測(cè)看anti－GST的抗體有沒(méi)有除盡．

c．beads與對(duì)應(yīng)的抗血清的結(jié)合．將連接好抗原的beads和對(duì)應(yīng)的抗血清一起孵育，封口后排氣，在轉(zhuǎn)子上固定好，孵育，室溫2 h或4℃過(guò)夜，讓血清流出純化管，收集，10 m L PBS洗滌三次．

d．收集抗體．加入10 mL p H5．0甘氨酸，預(yù)洗脫，加入預(yù)冷的HCl洗脫液．同時(shí)檢測(cè)收集的抗體濃度，確定收集峰，收集濃度高抗體，于4℃暫時(shí)保存．

e．濃縮和透析．將濃度不高的抗體吸水濃縮，注意放4℃保持低溫．濃縮好后透析．次日檢測(cè)收集的抗體濃度，確定收集峰．收集濃度高抗體，于4℃暫時(shí)保存．

f．beads的清洗和保存．依次用Tris和PBS洗，加入甘油、防腐劑－20℃保存．

1．2．3 ELISA 檢測(cè)［6－8］a．抗原包被．用抗原包被液（1 mol／L的 Na HCO3）稀釋抗原，50微升／孔，蛋白量為2～3μg／m L，孵育，室溫2 h或4℃過(guò)夜，用GST標(biāo)簽蛋白作對(duì)照．

b．封閉．倒出孔內(nèi)溶液，拍干，每孔加入100 u L稀釋液 （3% 脫脂牛奶＋PBST），封閉，放搖床上室溫孵育1 h．

c．加一抗．倒出孔內(nèi)溶液，拍干，洗3次，每次5 min．倒出孔內(nèi)溶液，拍干，加入一抗，搖床上室溫孵育1 h．

d．加二抗．倒出孔內(nèi)溶液，拍干，洗三次，每次5 min．倒出孔內(nèi)溶液，拍干，加入二抗，搖床上室溫孵育1 h．

e．加底物顯色．TMB顯色液A、B按1∶1混合，100μL／孔，放搖床上15 min內(nèi)觀(guān)察結(jié)果，照相．

f．SDS－PAGE電泳．電泳時(shí)間一般4～5 h，電壓為40 V較好，也可用60 V．電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜．

g．轉(zhuǎn) 膜．

（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7．0～8．3 cm 的濾紙和1張7．3～8．6 cm的PVDF膜，將切好的PVDF膜置于甲醇上浸才可使用．

（2）在加有轉(zhuǎn)移液的塑料盒里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜．

（3）將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平．在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡．

（4）要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬．撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻璃板．小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡．在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡．最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子．整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡，膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路．

（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面．電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫．一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h．（6）轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min，然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白．將膜晾干備用．

h．免疫反應(yīng)．

（1）將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h．

（2）將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度，撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，再用TBS洗一次．

（3）準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBST洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)．

i．化學(xué)發(fā)光、顯影、定影［9－10］．

（1）將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合，1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸，1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入暗盒中．

（2）在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中；在紅燈下取出膠片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大??；打開(kāi)暗盒，把膠片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上暗盒，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開(kāi)暗盒，取出膠片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影．顯影時(shí)間一般為1～2 min（20～25℃），顯影結(jié)束后，馬上把膠片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10 min，以膠片透明為止，用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干．

2 結(jié)果與討論

2．1 GST柱子分析

免疫原是GST融合蛋白的血清，同時(shí)是純化GST柱子的穿流夜Ft GST融合蛋白，此時(shí)需過(guò)GST柱子，用來(lái)吸附掉anti－GST的抗體．圖1所示的是未過(guò)GST柱子的血清F和GST柱子的穿流液Ft加入TMB底物后顯色反應(yīng)，表1所示的是血清F與穿流液Ft的稀釋梯度［11－12］．

表1 血清F與穿流液Ft的稀釋梯度Table 1 Dilution gradient of serum F and transit fluid Ft

圖1 血清F（“1”）與穿流液Ft（“2”）的顯色反應(yīng)Fig．1 Chromogenic reaction of serum F and transit fluid

由圖1和表1可知：在四種梯度下，血清F加TMB底物顯色后四孔全部顯藍(lán)色，而穿流液Ft全部無(wú)色，說(shuō)明anti－GST已除干凈．

2．2 ELISA結(jié)果分析

圖2所示的是未過(guò)GST柱子的血清F、GST柱子的穿流液Ft和抗體Pu加入TMB底物后顯色反應(yīng)、表2所示的是血清F、穿流液Ft和抗體Pu的稀釋梯度．

圖2 血清F、穿流液Ft、抗體Pu的顯色反應(yīng)Fig．2 Chromogenic reaction of serum F，transit fluid Ft and antibody Pu

由圖2和表2可知，以Ft為參照，F(xiàn)、Ft、Pu顯色孔數(shù)依次為4，3，4，其中Ft的是底色．結(jié)果說(shuō)明血清還可以進(jìn)一步純化，而且收集的純化血清效果也不錯(cuò)，即稀釋度為1：500 000．

表2 血清F、穿流液Ft、抗體Pu的稀釋梯度Table 2 Dilution gradient of serum F，transit fluid Ft and antibody Pu

2．3 SDS－PAGE測(cè)定 ATG 12多克隆抗體濃度［13］

使用SDS－PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，圖3所示的是ATG12多克隆抗體的SDS－PAGE圖．如圖3所示：左邊的條帶為ATG12蛋白，右邊為marker條帶，marker的分子質(zhì)量圖中已經(jīng)標(biāo)出．以67 k D為參照來(lái)估測(cè)蛋白濃度，67 k D代表的marker質(zhì)量濃度為每10μL含8μg，而目的蛋白的顏色只有其5／8深，則蛋白濃度為每10μL 5／8×8μg，即每10μL為5μg．

圖3 ATG12多克隆抗體的SDS－PAGEFig．3 SDS－PAGE of ATG12 polyclonal antibody

圖4 免疫印記蛋白質(zhì)大小Fig．4 Size of Immune mark protein

2．4 Western blotting分析

圖4所示的是免疫印記蛋白質(zhì)大小及在Colon（結(jié)腸）中的表達(dá)條帶中的表達(dá)情況．

由圖4可知：Western blotting條帶上的點(diǎn)清晰，說(shuō)明其能在結(jié)腸中較好的表達(dá)，由圖知蛋白質(zhì)大小為55 k D左右．

3 結(jié) 語(yǔ)

使用帶GST標(biāo)簽的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備得到ATG12多克隆抗體，運(yùn)用ELISA及Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示此抗體效價(jià)及特異性較高，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示其在結(jié)腸組織中表達(dá)，SDS－PAGE結(jié)果顯示其濃度也較高．本研究成功得到濃度較高的ATG12多克隆抗體，并證實(shí)其在結(jié)腸組織中表達(dá)較明顯．

致謝

感謝天惠生物公司對(duì)本研究的支持與幫助．

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