王曉敏 侯占銘

摘 要： 基因敲除（gene knock-out）又稱基因打靶，是通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。2007的諾貝爾得獎(jiǎng)項(xiàng)目就是用胚胎干細(xì)胞在小鼠特性基因修飾技術(shù)中的重大成就。這個(gè)重大獎(jiǎng)項(xiàng)的頒發(fā)，使基因敲除這項(xiàng)高科技更加全面地展現(xiàn)在世人面前。這項(xiàng)技術(shù)從20世紀(jì)70年代一直發(fā)展至今，對(duì)人類作出了一定的貢獻(xiàn)，但是由于技術(shù)要求比較高，因此還有很多缺點(diǎn)需要科學(xué)家共同努去克服，使其能在各個(gè)方面為人類作出更大的貢獻(xiàn)。從基因敲除技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，它的前景會(huì)越來(lái)越廣闊。

關(guān)鍵詞： 基因敲除 胚胎干細(xì)胞 同源重組

2007年10月8號(hào)，諾貝爾生物或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)，得獎(jiǎng)?wù)呤敲绹?guó)遺傳學(xué)家馬里奧·卡佩奇安德（Mario R.Capechiand）、奧利弗·史密塞斯（Oliver Smithies）和英國(guó)遺傳學(xué)家馬丁·埃文斯（Martin J.Evans）。得獎(jiǎng)項(xiàng)目就是他們用胚胎干細(xì)胞在小鼠特性基因修飾技術(shù)中的重大成就?？ㄅ迤姘驳乱?yàn)樵凇盎虼虬小钡募夹g(shù)研究上有突破性工作而聞名世界，幾乎同時(shí)史密塞斯也對(duì)此技術(shù)作出了巨大的奠基性的貢獻(xiàn)，埃文斯是世界上最先從小鼠體內(nèi)分離出胚胎干細(xì)胞，從而促進(jìn)應(yīng)用“基因敲擊小鼠”技術(shù)的科學(xué)家。由這一重大創(chuàng)舉，許多科學(xué)家和未來(lái)學(xué)家這樣預(yù)言：21世紀(jì)將是生命科學(xué)的世紀(jì)，在此基礎(chǔ)上，醫(yī)學(xué)也將迅猛發(fā)展。1990年人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)，同時(shí)包括了人類基因圖譜的繪制，隨著這個(gè)偉大計(jì)劃的完成，對(duì)未知基因的功能探索和研究將成為21世紀(jì)的熱點(diǎn)領(lǐng)域，一些動(dòng)物模型和其他模式生物將成為研究基因功能的工具。

1.基因敲除的基本原理

在早期的一些生理學(xué)的研究中，科學(xué)家們?yōu)榱四茉敿?xì)了解動(dòng)物某一器官的某一部分的具體功能，采用器官切除的方法，也就是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需要研究的器官或部分切除，之后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的某些生理生化指標(biāo)與功能的改變，從而判斷這個(gè)器官或部分的具體功能，指標(biāo)異常和生理缺陷的具體表現(xiàn)就是被切除組織的功能。[1]在現(xiàn)如今分子水平如此發(fā)達(dá)的今天，對(duì)于一個(gè)已知結(jié)構(gòu)而功能卻未知的基因，我們用類似的方法進(jìn)行此基因的功能研究，即將某一基因或一部分切下，然后觀察被實(shí)驗(yàn)動(dòng)植物的狀態(tài)、表型和其他性狀的變化判斷基因的具體功能。這種最新的研究基因功能的方法就是基因敲除（knock out）。經(jīng)典遺傳學(xué)（Forward genetics）是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列，而現(xiàn)代遺傳學(xué)（Reverse genetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測(cè)其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能?；蚯贸纸谢虼虬?，是將一段無(wú)關(guān)的DNA片段用來(lái)取代某一特定的基因，也是最簡(jiǎn)便的令基因失活的方法，是揭示基因功能最直接的手段之一?；蚯贸幕驹硎窃谝欢螣o(wú)關(guān)片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的序列，將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細(xì)胞，然后基于同源重組（homologous bination）的機(jī)制，可使無(wú)關(guān)片段取代靶基因整合到染色體中。同源重組是指發(fā)生在非姐妹染色單體（sister chromatin）之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合，[2]這種現(xiàn)象普遍存在于噬菌體、細(xì)菌和真核生物中。

為了便于敲除之后的篩選，用于取代靶基因的外源DNA中都含有報(bào)告基因，一般都是選用抗生素的抗性基因，在其兩側(cè)連接同源重組序列后就組成一個(gè)“缺失盒框”（deletion cassette）?；蚯贸梢愿淖?cè)蚪M的組成，使其產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)，在一定程度上終止原基因的表達(dá)。在某些時(shí)候，也會(huì)有這種情況的發(fā)生，就是用正常的基因敲除突變基因，這樣做有可能使原來(lái)突變的某基因轉(zhuǎn)變?yōu)樵嫉囊吧?。[3—4]總之，基因敲除是一門精細(xì)的修飾與改造真核生物基因組的新技術(shù)。[3]基因敲除從20世紀(jì)80年代發(fā)展至今，已經(jīng)經(jīng)歷過很多次的技術(shù)更新，從一開始最簡(jiǎn)單的完全敲除發(fā)展到現(xiàn)如今的條件敲除，慢慢地向著更有難度的特定組織基因敲除、特定時(shí)間基因敲除的可調(diào)控敲除方向發(fā)展。[5]完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性，而條件型基因敲除是指將某個(gè)基因的修飾限定于特定類型的細(xì)胞或個(gè)體發(fā)育特定的階段，即通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。

2.基因敲除的技術(shù)路線

真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。

從動(dòng)物的角度來(lái)講，老鼠是一種廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)及科研的模式生物，因?yàn)槔鲜蟮幕蚪M組成與人類基因組的組成極為類似。與酵母不同，老鼠是多細(xì)胞生物，基因的功能常常與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，具有組織專一性。若要觀察并得知某一基因的表型，則需要獲得老鼠的完整個(gè)體，科學(xué)家們經(jīng)過多年的實(shí)驗(yàn)與研究，終于解決了這一問題。解決方法就是利用一類特殊的老鼠細(xì)胞，就是我們所知的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）。ES細(xì)胞不同于一般的老鼠細(xì)胞，它是從哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生的內(nèi)胚團(tuán)（inner cell mass）中分離出來(lái)的。胚胎干細(xì)胞本身是二倍體，而且能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能型，即潛在的可分化為所有類型細(xì)胞的能力，形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培育條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。[4]將缺失代換獲得的ES細(xì)胞注射到老鼠胚細(xì)胞中，使之混合成為嵌合體，胚細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育長(zhǎng)成的小老鼠也是嵌合體。然后將嵌合體的老鼠互相交配，從其子代中可獲得基因型純合的缺陷個(gè)體。這些老鼠個(gè)體的每個(gè)細(xì)胞都攜帶失活的基因，稱其為剔除老鼠（knock-out mice）。通過觀測(cè)剔除老鼠的表型即可獲知失活基因相關(guān)功能的信息。該項(xiàng)技術(shù)適用于許多基因的功能檢測(cè)，但有些基因的缺陷在純合時(shí)是致死的，此時(shí)實(shí)驗(yàn)程序要做出相應(yīng)的修改。可將有缺陷的嵌合體老鼠與正常老鼠交配，生下幼崽后，有缺陷的雜合老鼠的表型仍舊會(huì)表現(xiàn)得有些異常，可據(jù)此再重新分析缺陷基因的功能。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。

從植物方面講，擬南芥是最常用的模式生物之一。隨著擬南芥的模式植物的基因組序列測(cè)定的完成，這些基因的功能研究就被提上日程。擬南芥作為模式植物，是世界上第一個(gè)完成基因測(cè)序的開花植物，但這些基因中有高達(dá)90%以上的基因是未知功能的，這就需要用反向遺傳學(xué)來(lái)逐一鑒定這些基因各自的功能。[6]T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段?；驹砭褪抢酶┺r(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報(bào)告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”。具體過程是首先將目的基因與啟動(dòng)子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子，接著將這個(gè)嵌合DNA分子插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)，使其構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，還要利用重組的農(nóng)桿菌細(xì)胞感染植物，目的是將質(zhì)粒部分DNA包括目的基因整合到植物染色體中實(shí)現(xiàn)最終遺傳轉(zhuǎn)化。使用T-DNA插入突變可以直接在基因組DNA中產(chǎn)生穩(wěn)定的插入突變，而不需要使用額外的步驟穩(wěn)定。有研究表明，T-DNA標(biāo)簽在擬南芥中的分布并非是完全隨機(jī)的，而是有一定的偏向性，但這種分布的偏向性并不影響利用T-DNA插入突變來(lái)飽和基因組。有的時(shí)候，T-DNA有一些缺點(diǎn)，例如這種方法只適用于部分植物，而這些植物是容易被T-DNA轉(zhuǎn)化的才可以。再例如T-DNA整合還能出現(xiàn)一些復(fù)雜情況，有時(shí)還會(huì)引起染色體重排的現(xiàn)象，使得實(shí)驗(yàn)后續(xù)的結(jié)果分析變得艱難。盡管有這樣那樣的缺點(diǎn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化擬南芥的方法還是得到了極大的推廣和發(fā)展。

3.基因敲除的發(fā)展過程

基因敲除技術(shù)最早是于20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的，最早的研究對(duì)象被定為酵母細(xì)胞。開始是將大多數(shù)的外源DNA片段通過同源重組整合到基因組內(nèi)，隨機(jī)插入僅占小部分，多為同源位點(diǎn)整合。在科學(xué)家們的共同努力下，于80年代的早期，基因敲除漸漸發(fā)展到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞。自從1981年小鼠的胚胎干細(xì)胞被美國(guó)和英國(guó)的兩位科學(xué)家成功地分離出來(lái)后，胚胎干細(xì)胞基因敲除的技術(shù)就慢慢發(fā)展起來(lái)，并被廣泛利用，日趨成熟。1984年，Bradly等把從小鼠體內(nèi)分離出來(lái)的胚胎干細(xì)胞株移植入胚泡腔，這個(gè)實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了從小鼠體內(nèi)分離出來(lái)并在體外培育的ES細(xì)胞是能夠在母鼠體內(nèi)發(fā)育成生殖嵌合體的，也能在適當(dāng)交配后得到純合體子代。在1985年，Smithies等首次成功利用基因敲除技術(shù)證實(shí)了利用同源重組對(duì)生物體的遺傳信息進(jìn)行定向改造的可能性。[7]1987年，Thomas等選擇了X連鎖的hprt基因作為靶基因，首次在胚胎干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因敲除。同一年，也有被稱為早期基因敲除經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一的小鼠hprt基因的定點(diǎn)突變。1989年，真正的基因敲除小鼠誕生。[8]到了20世紀(jì)90年代后，基因敲除技術(shù)發(fā)展更迅速，多種方法手段應(yīng)運(yùn)而生，得到了更多的應(yīng)用，使基因敲除在生物技術(shù)領(lǐng)域的地位更加穩(wěn)固。

4.基因敲除的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

基因敲除既然能被選作為2007年的諾貝爾獎(jiǎng)，自然說(shuō)明這項(xiàng)技術(shù)有一定的優(yōu)點(diǎn)。其一，基因敲除這項(xiàng)技術(shù)的適用范圍很廣，既可以是原核細(xì)胞，又可以是真核細(xì)胞，不過較多的時(shí)候，這項(xiàng)技術(shù)還是被用在真核生物的研究上。其二，基因敲除發(fā)展至今已經(jīng)相對(duì)成熟，也是目前能精確修飾基因組的一個(gè)有效方法。人們可以按照自己設(shè)計(jì)好的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)一些結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的細(xì)胞基因組進(jìn)行定點(diǎn)、定量的改變，從而達(dá)到自己的目的，也就是定向地改變實(shí)驗(yàn)對(duì)象的遺傳結(jié)構(gòu)和特征，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，這些被改造過的基因是可以隨染色體DNA復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制的，也就是說(shuō)這些基因所表達(dá)出來(lái)的性狀是可以穩(wěn)定遺傳的。其三，和其他手段相比更安全。

科學(xué)不斷進(jìn)步，如此先進(jìn)的技術(shù)肯定會(huì)有自身的不足之處。這種技術(shù)命中率低，操作較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，所用藥品或其他儀器費(fèi)用偏高；因?yàn)榛蚬δ芪粗?，所以在?shí)驗(yàn)研究的過程中，敲除掉了一些有特殊功能的基因，而若這些基因一旦不存在，細(xì)胞就會(huì)死亡，這些致死基因就無(wú)法研究；有些基因的功能很復(fù)雜，當(dāng)它被敲除掉時(shí)，原本是要觀察表型判斷功能，卻會(huì)由于此基因功能的復(fù)雜性而沒能形成容易識(shí)別的表型，又或者是其他沒被敲除的基因也有和被敲除基因同樣的功能，而使表型變化不明顯，導(dǎo)致研究進(jìn)行不順利；實(shí)驗(yàn)易受非同源重組隨機(jī)插入的干擾，等等。這些不足說(shuō)明，基因敲除技術(shù)雖已發(fā)展較為成熟，但科學(xué)家們需要進(jìn)一步努力，使之更加完善。

5.基因敲除的應(yīng)用

5.1在培育動(dòng)植物方面的應(yīng)用

基因敲除技術(shù)已經(jīng)在動(dòng)植物身上有了研究成果，現(xiàn)已可用基因敲除技術(shù)使一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的生產(chǎn)性能、抗病力等獲得重大的提高，為人類提供所需要的優(yōu)良品種。

5.2在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

現(xiàn)階段人類對(duì)很多疾病還是束手無(wú)策，而基因各項(xiàng)技術(shù)的逐步發(fā)展都是非常漫長(zhǎng)的，需要科學(xué)家的努力，所以在這個(gè)過程中，人類疾病的動(dòng)物模型就顯得非常重要，若將這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果慢慢作用于人類身上，則為人類的各種疾病獲得更好的治療是指日可待的。

5.3在食物方面的應(yīng)用

基因敲除技術(shù)在動(dòng)植物，尤其是食用性的植物或動(dòng)物身上的研究結(jié)果，都是為了獲得某型更優(yōu)良的性狀，可以為人類提供更優(yōu)質(zhì)的食物。

5.4在微生物育種方面的應(yīng)用

近些年來(lái)，微生物在解決人類糧食、能源、健康和環(huán)境保護(hù)等方面問題的作用越來(lái)越重要，但隨著社會(huì)進(jìn)步和科技發(fā)展，微生物育種遇到了很多難題，而基因敲除技術(shù)已在這個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。具體應(yīng)用于構(gòu)建具有特定突變的工程菌，改變生物代謝途徑，阻斷副反應(yīng)的進(jìn)行，防止副產(chǎn)物或有毒產(chǎn)物的形成，等等。[9]

6.基因敲除的前景

基因敲除技術(shù)從20世紀(jì)70年代發(fā)展至今，在很多領(lǐng)域已經(jīng)占據(jù)了其他技術(shù)不能取代的地位，其克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾和改造基因的方法。它有廣闊的發(fā)展前景，這就需要科學(xué)家們共同努力。人類基因組計(jì)劃的啟動(dòng)，包括人類基因圖譜的繪制完成，人類對(duì)未知基因的功能探索和研究將成為21世紀(jì)的熱點(diǎn)領(lǐng)域，這項(xiàng)技術(shù)會(huì)越來(lái)越成熟，會(huì)對(duì)全人類作出更多更大的貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

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[9]張紅巖，申乃坤，周興.基因敲除技術(shù)及其在為生物育種中的應(yīng)用[J].釀酒科技，2010（04）.

通訊作者：王曉敏