王海強等

【摘 要】目的：探討益氣活血化瘀法對大鼠肝癌前病變TGF-β1、Smad4的影響。方法：80只雄性Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，用二乙基亞硝胺誘導肝癌的發(fā)生發(fā)展，以益氣活血化瘀法對肝癌大鼠進行ELISA法TGF-β1、Smad4統(tǒng)一測定；另常規(guī)取材按電子和光學顯微鏡觀察固定，并觀察其病理組織學變化。結果：與模型組相比，中藥高、低劑量組在4、12、20周時TGF-β1、Smad4明顯上調。結論：TGF-β1、Smad4與肝癌的發(fā)生密切相關，益氣活血化瘀法通過促進肝臟組織TGF-β1、Smad4的表達，從而對減緩大鼠肝癌的形成有一定作用，同時，益氣活血化瘀法對肝癌前病變肝臟組織亦有明顯改善作用。

【關鍵詞】益氣活血化瘀法；肝癌前病變；TGF-β1；Smad4

肝癌細胞的凋亡在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，而TGF-β1、Smad4蛋白酶在肝癌凋亡信號傳導中起重要的作用，研究表明TGF-β1、Smad4蛋白酶的激活與肝癌細胞凋亡有密切聯(lián)系[1-2]。因此，在肝癌的預防及治療工作中研究TGF-β1、Smad4是十分有必要的。我們綜合前期的研究成果認為益氣活血化瘀法對肝癌前病變細胞有顯著的防治作用，為了探討該法在肝癌細胞和肝癌相關疾病過程中的作用機理，我們應用二乙基亞硝胺（DEN）方法誘導大鼠肝癌細胞模型，進一步觀察該法在肝癌促癌過程中對Smad4、TGF-β1的變化及影響。

1 材料與方法

1.1 藥物：中藥組成：黃芪、炒白術、丹參、川芎、當歸、石見穿、地蟞蟲，分別配制成含有生藥濃度0.5g/ml 、1.0g/ml的兩種中藥制劑.

1.2 動物：清潔級雄性Wistar大鼠共80只，大鼠體重80克～100克，大鼠由長春高新醫(yī)學動物研究中心提供.實驗動物大隨機分空白組、模型組、中藥低劑量組和中藥高劑量組4組。

1.3試劑與設備：TGF-β1、Smad4試劑盒購買于南京建成試劑有限責任公司；二乙基亞硝胺由Sigma公司生產；加樣槍德國生產；德國離心機CR21型；日本MDF-V50V型超低溫冰箱；玻璃勻漿器；分光光度儀，美國生產。

1.4 實驗方法：在第1周將正常組大鼠腹腔注射生理鹽水100mg/kg，將模型組、中藥組大鼠腹腔注射DEN造模，劑量為100mg/kg.從第2周開始，中藥組大鼠和模型組大鼠按每周70mg/kg DEN的水溶液劑量，連續(xù)灌胃20周.造模成功后，中藥低劑量組給予每日生藥含量0.5g/ml的中藥湯劑按10ml/kg灌胃，每日進行1次；中藥高劑量組按1.0g/m標準進行，每日1次；正常組和模型組大鼠給予10ml/kg生理鹽水每日1次灌胃，共20周.4組分別于喂養(yǎng)第4、第12、第20周時，各組分別取5只大鼠殺死后取肝臟組織，第20周時將其余大鼠全部殺死后剖取肝臟.并在肝臟左葉的取相同的部位取材，除去血液后拭干，并按2g：2ml的比例加如入冰鹽水，用玻璃勻漿器在冰浴中制作成勻漿.在離心機離心20分鐘后取離心上清液封存，置于低溫冰箱保存?zhèn)溆?

1.5 統(tǒng)計分析：各組數據以（均數±標準差）表示，應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件計學處理.檢驗方法用方差分析，組間的比較采用LSD法檢驗和q（SNK法）

2 結果

3 電鏡下病理改變

正常組：細胞多成圓形或核圓，可見1至2個核仁，在肝臟細胞漿內見有線粒體、糖原顆粒結構、粗面內質網結構.

模型組：可見細胞排列紊亂，肝臟細胞核形不規(guī)整，線粒體、滑面內質網增多，大部分線粒體嵴顯示不清，粗面內質網明顯擴張，出現次級溶酶體增多.

中藥低劑量組：可見鏡下肝臟細胞排列不規(guī)則，細胞膜不規(guī)整，肝細胞核縮小，細胞核形態(tài)不規(guī)整，見少量線粒體膜性結構融合，粗面內質網結構可見輕度擴張，肝臟胞漿內見少量次級溶酶體.

中藥高劑量組：可見鏡下肝臟細胞排列不規(guī)整，肝臟核膜有皺縮，線粒體大小形態(tài)未見明顯改變，線粒體嵴顯示欠清，滑面內質網少部分增生.

4 光鏡下病理改變

空白組：各個時期的大鼠肝臟細胞形態(tài)基本正常，細胞排列基本完整，肝小梁、肝血竇排列基本正常。

模型組：4周時出現部分肝臟細胞變性、壞死、甚至空泡樣改變；12周時，肝臟細胞纖維化出現。肝臟局限性增生結節(jié)形成，數量逐漸增多。部分肝臟出現核異質變性；20周時，增生結節(jié)呈逐漸增大，結節(jié)內肝臟細胞異型性出現，部分表現為核異質變性，異性細胞結發(fā)展，癌變細胞于結節(jié)中出現。

低劑量組：4周時，未見細胞空泡樣變性；12周時，異常增生節(jié)形成，部分纖維化改變出現。20周時，病變相當于模型組第12周的改變，未見明顯的肝臟癌變細胞。

高劑量組：第4周時，與低劑量組基本相同；12周時，肝臟細胞異常增生結節(jié)明顯形成，少部分大鼠出現部分纖維化改變，但程度較輕。20周時，肝細胞改變與模型組第12周相近，但程度仍較輕。

5 討論

研究發(fā)現，Smad4為TGF-β1信號傳遞蛋白，兩者在惡性腫瘤中的表達密切相關，Smad4是TGF-β1的信號從胞質傳導到細胞核內的中介分子，在TGF-β1誘導基因表達調控和隨后的生長抑制中是必不可少的關鍵轉錄因子[3]。TGFβ1/Smads信號轉導通路的改變在許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用，TGFβ1/Smads信號轉導通路通過調節(jié)基因轉錄，使細胞生長抑制、分化或凋亡，這一通路中的任一環(huán)節(jié)異常都會導致細胞生長分化失去控制。

實驗結果表示，益氣活血化瘀法在大鼠肝癌的形成過程中能明顯上調肝臟TGF-β1的表達水平和下調肝臟Smad4的表達水平，對TGF-β1、Smad4的作用具有一定的劑量依賴性。因此我們分析，益氣活血化瘀法可能通過上調TGF-β1和下調Smad4水平來抑制大鼠肝癌細胞的形成水平來抑制大鼠肝癌的形成。通過光鏡、電鏡組織病理改變，提示益氣活血化瘀法對肝癌前病變組織有明顯的修復作用。

參考文獻：

[1] He Y，Yang F，Wang F，et al. The upregulation of expressedproteins in HepG2 cells transfected by the recombinant plas-mid-containing HBx gene[J]. Scand J Immunol， 2007， 65（3）：249-256.

[2] Migita K， Miyazoe S， Maeda Y， et al. Cytokine gene poly-morphisms in Japanese patients with hepatitis B virus infec-tion--association between TGF-beta1 polymorphisms and hep-atocellular carcinoma[J]. J Hepatol，2005， 42（4）： 505-510.

[3] Migita K， Miyazoe S， Maeda Y， et al. Cytokine gene poly-morphisms in Japanese patients with hepatitis B virus infec-tion--association between TGF-beta1 polymorphisms and hep-atocellular carcinoma[J]. J Hepatol，2005， 42（4）： 505-510.

[4] Hesling C，Fattet L，Teyre G，Jury D，Gonzalo P，LopezJ，Vanbelle C，Morel AP，Gillet G，Mikae-lian I，Rimokh R.Antagonistic regulation of EMT by TIF1 and Smad4 in mammary epithelial cells.EMBO Rep 2011；12：665-672