孟玉平 ，曹秋芬 ，2，，郭慧娜 ，，任 瑩 ，王國(guó)平

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；3.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西太谷030815）

為了從分子水平了解棗樹(shù)適應(yīng)性強(qiáng)、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄的特性，為農(nóng)作物的抗性育種提供優(yōu)良的功能基因，近年來(lái)山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心果樹(shù)生物技術(shù)課題組構(gòu)建了棗樹(shù)結(jié)果枝（落性枝）的cDNA文庫(kù)[1]，并對(duì)獲得的一些與抗逆性有關(guān)的功能基因進(jìn)行了深入的研究。ZjAPX（DDBJ/EMBL/GenBank的注冊(cè)號(hào)為AB608053）是其中獲得的一個(gè)棗樹(shù)抗壞血酸氧化酶基因，對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)蛋白的研究[2]和cDNA序列生物信息學(xué)分析及完整開(kāi)放閱讀框植物表達(dá)載體 PEZR（K）-LNY-ZjAPX的構(gòu)建[3]。大量的研究表明，抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因（APX）的表達(dá)受各種環(huán)境脅迫因子（如干旱、高鹽、除草劑、低溫、病原菌侵染）的誘導(dǎo)[4-6]。

本研究以棗樹(shù)組織培養(yǎng)苗為供試材料，探討了在不同濃度的NaCl和PEG6000模擬干旱脅迫條件下ZjAPX基因的表達(dá)，以了解棗樹(shù)ZjAPX在逆境脅迫時(shí)的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的NaCl，PEG6000及MS培養(yǎng)基中所用試劑均購(gòu)自天津天大化工；植物激素6-BA和 NAA，PEG6000，飽和酚，DEPC，RNA提取所用到的試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；DL 2000Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ PrimeScriptRRTMaster Mix），熒光定量PCR試劑盒（SYBQRPremix EX TaqTMⅡ），熒光定量過(guò)程中所用的PCR管均購(gòu)自大連TaKaRa（寶生物）工程有限公司；用于PCR鑒定和熒光定量的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；熒光定量PCR儀為Applied Biosystems的 7300Real Time PCR System。

植物材料采用組織培養(yǎng)的棗樹(shù)苗（Ziziphus jujuba Mill）。 繼代培養(yǎng)基為：MS＋6-BA 0.5mg/L＋瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0；生根培養(yǎng)基為：1/2 MS＋NAA 0.3mg/L＋肌醇50mg/L＋瓊脂6 g/L，pH值 5.8～6.0。培養(yǎng)室溫度為（25±1）℃，光照周期12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 棗苗脅迫處理 選取生長(zhǎng)30～40 d健壯且長(zhǎng)勢(shì)較一致的生根棗苗植株用于脅迫處理。將植株放入加有NaCl和PEG6000的液體生根培養(yǎng)基中，單株處理，重復(fù)3次，以植株放入不加NaCl和PEG6000的液體生根培養(yǎng)基為對(duì)照。

PEG6000滲透壓處理分別為 0.5，1.2MPa，處理后分別于 1，4，7，24，48 h取樣。NaCl濃度處理分別為 50，300mmol/L，處理后分別于 3，6，24，48 h取樣。所取樣品立即冷凍于液氮后保存于-70℃冰箱，用于RNA的提取。

1.2.2 RNA提取和質(zhì)量檢測(cè) 采用CTAB法[7]提取1.2.1處理樣品的總RNA，用DNaseⅠ除去DNA。用蛋白核酸分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的OD和A260/A280值，甲醛變性凝膠電泳觀察總RNA條帶的完整性。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1.2.2提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：5×Prime ScriptRBuffer4μL，TotalRNA 1μg，總體積15μL；反應(yīng)條件：37℃ 15min，85℃ 5 s。 反轉(zhuǎn)錄后測(cè)定OD值，并稀釋成為100 ng/μL作為模板cDNA用于熒光定量分析。

用Real-time PCR相對(duì)定量的方法分析棗植株在不同脅迫條件下ZjAPX mRNA的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參基因選用棗樹(shù)組蛋白ZjH3基因[8-9]（GenBank：EU916201），根據(jù)其序列設(shè)計(jì)特異性引物。 上游引物 H1：5′-GAGGAAGCAACTGGCAAC TAAGG-3′；下游引物 H2：5′-ACCAGCCTCTGGA ATGGAAGTTTG-3′，可擴(kuò)增出 165 bp的片段。目的基因ZjAPX的上游引物X1：5′-TCGATATCGC TGTCAGACTAC-3′；下游引物 X2：5′-TTGTCCTC TCTTCCTGGATG-3′，可擴(kuò)增出145 bp的片段。引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.4 熒光定量PCR 定量PCR反應(yīng)體系總體積 20μL，包括上下游引物各 0.4μL（ 20 pmol/μL），cDNA1μL（100 ng），SYBRRPremix EX TaqTMⅡ10μL，ROX Reference Dye 0.4μL，ddH2O 7.8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸31 s，循環(huán)40次。基因相對(duì)定量表達(dá)分析 采 用 2-ΔΔCt法， 其 中，ΔΔCt＝ 處 理 棗 苗（ Ct（ZjAPX）值－Ct（Actin） 值）－對(duì)照棗苗（Ct（ZjAPX）值－Ct（Actin）值），每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗組培苗脅迫處理后形態(tài)學(xué)觀察

將正常生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)較一致的棗組培苗進(jìn)行NaCl和模擬干旱PEG6000處理，各處理短時(shí)間脅迫后植株外觀形態(tài)上沒(méi)有什么異常，當(dāng)處理至24 h時(shí)，300mmol/LNaCl和 1.2MPa PEG6000溶液處理過(guò)的棗組培苗葉片開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫；處理至48 h時(shí)，300mmol/L NaCl處理的棗組培苗葉片變白，有死亡跡象，1.2MPa PEG6000溶液處理的組培苗葉片全部變白死亡。

2.2 RNA的質(zhì)量檢測(cè)

用蛋白核酸分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的總RNA，結(jié)果表明，其A260/A280值在1.8～2.0之間，甲醛變性凝膠電泳發(fā)現(xiàn)28S和18S的rRNA條帶完整，28S的rRNA條帶亮度為18S的rRNA條帶亮度的2倍，表明總RNA有較好的完整性和純度，能滿足反轉(zhuǎn)錄的要求。

2.3 PEG6000模擬干旱脅迫下ZjAPX的表達(dá)

由圖1可知，在不同滲透壓、不同時(shí)間的PEG6000處理?xiàng)椊M培苗后，ZjAPX的表達(dá)量不同。0.5MPa處理下，1 h時(shí)ZjAPX的表達(dá)量較低，為2.9，隨著脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量也增高，7 h時(shí)增加到17.4，但24 h又降低到11.3，48 h時(shí)最高（24.8）；增加PEG6000的濃度使?jié)B透壓達(dá)1.2 MPa時(shí)，處理1 h的ZjAPX表達(dá)量已增至9.9，4 h時(shí)最高（17.7），此后隨著時(shí)間的增加表達(dá)量降低，24 h稍有回升，48 h時(shí)植株已干枯死亡。整體趨勢(shì)表現(xiàn)為隨著干旱脅迫時(shí)間和滲透壓的增加，ZjAPX的表達(dá)量增高，在達(dá)到一定的量后開(kāi)始降低，干枯死亡之前又有一個(gè)高峰。

2.4 NaCl脅迫下ZjAPX的表達(dá)

由圖2可知，低濃度50mmol/L的NaCl脅迫下，3～48 h的ZjAPX的表達(dá)量一直在增加；高濃度 300mmol/L的 NaCl脅迫時(shí)，3～24 h的ZjAPX表達(dá)量在增加，24 h時(shí)最高（29.4），48 h時(shí)葉片表現(xiàn)出死亡跡象，ZjAPX的相對(duì)表達(dá)量降低到22.6。整體表現(xiàn)為隨著NaCl脅迫時(shí)間和濃度的增加，ZjAPX的表達(dá)量增高，當(dāng)達(dá)到一定量時(shí)表達(dá)量開(kāi)始降低，直至植株死亡。

3 討論與結(jié)論

干旱、鹽堿、低溫以及高溫等多種逆境將會(huì)破壞植物活性氧解毒系統(tǒng)，使活性氧累積損傷細(xì)胞膜。增強(qiáng)植物體內(nèi)活性氧清除酶類的活性及抗氧化代謝的水平是提高植物抗逆性的重要途徑之一。Gueta-Dahan等[10]通過(guò)比較耐鹽和鹽敏感柑橘中抗氧化酶的活性發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等的活性在二者之間差別不大，而耐鹽柑橘中的抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性大大高于鹽敏感柑橘。Tsugane等[11]也發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，在鹽脅迫條件下能進(jìn)行光合自養(yǎng)的擬南芥隱性突變體中，抗壞血酸過(guò)氧化物酶的活性顯著增強(qiáng)。馬長(zhǎng)樂(lè)等[12]利用Northern雜交分析了鹽地堿蓬A(yù)PX基因在400mmol/L NaCl脅迫下的表達(dá)，證明APX基因表達(dá)量增加，而且APX酶的活性也顯著增加，說(shuō)明該基因受鹽誘導(dǎo)，推測(cè)APX可能在保護(hù)鹽地堿蓬免受氧化損傷的過(guò)程中起到了一定作用。大量研究證明，植物在逆境下會(huì)誘導(dǎo)抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因表達(dá)[13-15]。

本研究利用組織培養(yǎng)植株生長(zhǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基均易控制的特點(diǎn)，探討了在其培養(yǎng)基中添加NaCl和PEG6000脅迫棗組培苗后ZjAPX基因的表達(dá)，結(jié)果表明，ZjAPX基因受NaCl和PEG6000誘導(dǎo)表達(dá)，而且在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，隨著濃度的增大和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量增高。說(shuō)明ZjAPX基因參與了植株抵抗鹽和干旱帶來(lái)的傷害，但隨著脅迫傷害的增大，植物體的耐性減弱，ZjAPX基因的表達(dá)隨之降低。為了進(jìn)一步證明ZjAPX基因在提高植物耐鹽、耐旱中的作用，將利用模式植物擬南芥繼續(xù)對(duì)ZjAPX基因的功能進(jìn)行鑒定。

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