趙昕嵐 鄧放明

ZHAO Xin-lan DENG Fang-ming

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

(1.Hunan Agricultural University Food Science and Technology College,Changsha,Hunan 410128,China;2.Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha,Hunan 410128,China)

荷葉（lotus leaf）是睡蓮科植物蓮（nelumbo nucifera gaerth）的葉。在2002年3月中國衛(wèi)生部衛(wèi)監(jiān)發(fā)（2002）第51號文件中，荷葉被列入“既是食品又是藥品”的名單之中[1]。近年的研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，荷葉除了含有碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、單寧等常規(guī)的化學(xué)成分外，還富含多種生物活性物質(zhì)，其中黃酮類和生物堿類化合物的生物活性較高。荷葉的藥理作用研究表明，荷葉主要具有調(diào)節(jié)血脂[4]、減肥、抗氧化[5]和抑菌等作用[6]。荷葉中的黃酮類化合物主要有槲皮素（quercetin）、異槲皮素（isoquercitrin）和蓮苷等[7,8]；生物堿物質(zhì)主要有荷葉堿、N-去甲荷葉堿、O-去甲荷葉堿、牛心果堿、亞美帕堿、原荷葉堿等[9]。目前，對荷葉的研究和利用，越來越受到人們的重視，其在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的前景。一些學(xué)者研究了不同采摘期荷葉中主要活性成分（黃酮或生物堿）含量的變化，但是荷葉在生長過程中每個(gè)月會不斷地長出新生荷葉，單純研究不同月份的荷葉不能夠充分反應(yīng)荷葉內(nèi)部主要活性成分的變化規(guī)律。因此，本試驗(yàn)對同一批新生荷葉進(jìn)行標(biāo)記，分不同月份采摘，再采用分光光度法測定荷葉中總黃酮和荷葉堿兩種物質(zhì)的含量變化，為篩選荷葉及合理采收提供理論指導(dǎo)，同時(shí)為進(jìn)一步有效控制荷葉質(zhì)量提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

荷葉：5月中旬、6月中旬、7月中旬、8月中旬、9月中旬、10月中旬和11月中旬采摘于湖南宏興隆食品有限公司湘蓮基地；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；

荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；

無水乙醇、甲醇、NaOH固體：分析純，中國國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠；

三氯甲烷、鹽酸：分析純，衡陽市凱信化工試劑有限公司；

蒸餾水：本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速中藥粉碎機(jī)：ZN-400A型，長沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-2AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子分析天平：AUY220型，日本Shimadzu公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2450型，日本Shimadzu公司；

恒溫水浴鍋：DZKW-S-4型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

pH計(jì)：PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-ⅢT型，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52-3型，上海滬西分析儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的收集 5月中旬時(shí)，在湘潭宏興隆食品有限公司的湘蓮基地，選擇剛立出水面，葉片尚未撐開的新生荷葉進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)記好的荷葉作為本試驗(yàn)的原材料。分別在5月中旬、6月中旬、7月中旬、8月中旬、9月中旬、10月中旬和11月中旬，采集被標(biāo)記過的荷葉。根據(jù)荷葉的生長天數(shù)及外觀特征，將荷葉的生長期分為以下幾個(gè)階段：立葉期、營養(yǎng)生長期、成熟期和衰亡期。不同生長期荷葉的外觀特征見表1。

表1 不同生長期荷葉的外形特征Table1 Shape characteristics of lotus leaf in the different growing periods

1.2.2 原料的預(yù)處理與提取 將新鮮的荷葉清洗干凈，放置在70℃的恒溫干燥箱中干燥4 h。將烘干后的荷葉用高速粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。備用。

稱取0.5 g荷葉粉末，按照料液比1∶35(m∶V)，加入60%乙醇溶液，50℃下超聲提取30min，抽濾后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無醇味，定容至50mL，即得到荷葉總黃酮提取液。稱取5 g荷葉粉末，按照1∶30(m∶V)的料液比，加入80%的乙醇溶液，在90℃下冷凝回流提取3 h。提取結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將粗提液中的乙醇揮發(fā)，用0.5%HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，抽濾，用40 mL氯仿分2次萃取，棄氯仿層，除去脂質(zhì)。在剩余的水層中加入0.5%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7左右。靜置數(shù)分鐘后，過濾，再加入0.5%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12以上。用100mL氯仿分3次萃取[10]，合并氯仿液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸干氯仿，加入一定量的甲醇，在超聲波清洗器中洗脫30min，定容至50mL，即得到荷葉堿提取液。

1.2.3 不同生長期荷葉中總黃酮含量的比較

(1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，溶于95%的乙醇溶液中，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容，搖勻，即得到0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

(2)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用NaNO2—Al(NO3)3—NaOH顯色方法測定黃酮含量[11]。精密吸取濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 分別于 25 mL的容量瓶中，用95%的乙醇溶液稀釋到10 mL，加入0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液，充分搖勻，靜置5 min，再加入0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)3溶液，充分搖勻，靜置5 min，再加入5mL 1mol/L的NaOH溶液，用95%的乙醇溶液定容至25mL，混勻放置10 min后，在510 nm處測定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，所對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)總黃酮含量的測定方法：精密吸取1 mL荷葉總黃酮提取液置于25 mL容量瓶中，按照上述方法顯色，在510 nm處測定其吸光度，并按式(1)計(jì)算總黃酮含量。

式中：

R——總黃酮含量，mg/g；

c——樣品吸光度對應(yīng)的蘆丁濃度，μg/mL；

w——荷葉質(zhì)量，g。

1.2.4 不同生長期荷葉中荷葉堿含量的比較

(1)荷葉堿的標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精確稱取荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品20mg，溶于甲醇溶液中，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容，搖勻，即得到0.4mg/mL的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液[12]。

(2)荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取0.4mg/mL的荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7mL，分別置于25mL容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，充分搖勻，以甲醇溶液為空白，在270 nm處測定吸光度[13]，以荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，所對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)荷葉堿含量的測定方法：精密吸取0.1mL荷葉堿提取液置于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度。以甲醇溶液為空白，在270 nm處測定吸光度，并按式(2)計(jì)算荷葉堿含量。

式中：

R——荷葉堿含量，mg/g；

c——樣品吸光度對應(yīng)的荷葉堿濃度，μg/mL；

w——荷葉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長期荷葉中總黃酮的含量變化規(guī)律

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在510 nm處測定系列蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，結(jié)果見圖1。由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性回歸方程為Y=0.010 7X+0.001 8，R2=0.999 8。蘆丁在濃度為0～48μg/mL內(nèi)線性良好。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of rutin

2.1.2 不同生長期荷葉中的總黃酮含量 不同生長期荷葉中總黃酮的含量見圖2。

圖2 不同生長期荷葉中黃酮含量變化規(guī)律圖Figure 2 Variation diagram of flavonoid contentof lotus leaf in the differentgrowing periods

由圖2可知，不同生長期荷葉中的總黃酮含量變化范圍在30.98～84.21mg/g。從立葉期到成熟期，荷葉中的總黃酮含量隨著荷葉的生長不斷增加；在8月中旬時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高值84.21mg/g；之后隨著荷葉的衰老，總黃酮的含量也迅速下降。這樣的變化規(guī)律可能是因?yàn)樵诤扇~的營養(yǎng)生長期中，荷葉不斷地從外界獲取營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)體內(nèi)的黃酮類物質(zhì)也不斷地積累；當(dāng)荷葉完全成熟時(shí)，體內(nèi)黃酮物質(zhì)的含量也達(dá)到最高值；當(dāng)荷葉進(jìn)入衰亡期時(shí)，荷葉干枯，體內(nèi)水分大量流失，可能也帶走了一些活性物質(zhì)，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)也不斷地?fù)p失。

由表2可知，不同生長期荷葉中黃酮含量是有極顯著差異的。由表3多重比較結(jié)果可知，在α=0.05水平下，8月中旬的荷葉中黃酮含量顯著高于其他月份的；且每個(gè)月份的荷葉中黃酮含量都存在顯著差異。在α=0.01水平下，8月中旬的荷葉中黃酮含量極顯著高于其他月份的；10月中旬的荷葉和6月中旬的荷葉中黃酮含量差異不顯著，其他月份的荷葉中黃酮含量差異均極顯著。

表2 不同生長期荷葉中黃酮含量的方差分析表Table2 Analysis of variance table of flavonoid content of lotus leaf in the differentgrowing periods

表3 不同生長期荷葉中黃酮含量的多重比較表（SSR法）Table3 Multiple comparisons table of the rate of flavonoid content of lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

表3 不同生長期荷葉中黃酮含量的多重比較表（SSR法）Table3 Multiple comparisons table of the rate of flavonoid content of lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

相同字母表示兩者間差異不顯著，不同字母表示兩者間差異顯著。

類型 平均數(shù)/(mg·g-1) 差異顯著性α=0.05 α=0.01 8月中旬9月中旬7月中旬10月中旬6月中旬11月中旬5月中旬84.21 65.68 60.83 54.24 52.72 42.33 30.98 a b c d e f g ABCDDEF

2.2 不同生長期荷葉中荷葉堿的含量變化規(guī)律

2.2.1 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在270 nm處測定系列荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，結(jié)果見圖3。由圖3可知，荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性回歸方程為Y=0.072 7X-0.013 8，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 3。結(jié)果表明，荷葉堿在濃度為0～11.2μg/mL內(nèi)線性良好。

圖3 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 3 Standard curve of nuciferine

2.2.2 不同生長期荷葉中的荷葉堿含量 不同生長期荷葉中荷葉堿的含量見圖4。

圖4 不同生長期的荷葉中荷葉堿含量變化規(guī)律圖Figure 4 The variation diagram of nuciferine content of lotus leaf in the different growing periods

由圖4可知，不同月份的荷葉中荷葉堿含量變化范圍在1.084～2.132mg/g。從立葉期到成熟期，荷葉中的荷葉堿含量隨著荷葉的生長不斷增加；7、8月時(shí)，荷葉中荷葉堿含量迅速升高，在8月時(shí)，達(dá)到了最高含量2.132mg/g；可能是因?yàn)椋扇~在7、8月處于營養(yǎng)生長期，荷葉內(nèi)迅速積累生物堿類物質(zhì)；當(dāng)荷葉成熟后，進(jìn)入衰亡期，荷葉堿的含量逐漸下降。

由表4可知，不同生長期荷葉中荷葉堿含量是有極顯著差異的。由表5多重比較結(jié)果可知，8月中旬、9月中旬、10月中旬和11月中旬的荷葉之間荷葉堿含量沒有顯著差異，但是荷葉堿含量極顯著高于6月中旬和5月中旬的荷葉中荷葉堿含量。6月中旬和5月中旬的荷葉之間荷葉堿含量也沒有顯著差異。

表4 不同生長期荷葉中荷葉堿含量的方差分析表Table4 Analysis of variance table of nuciferine content of lotus leaf in the different growing periods

表5 不同生長期荷葉中荷葉堿含量的多重比較表（SSR法）Table5 Multiple comparisons table of the rate of nuciferine contentof lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

表5 不同生長期荷葉中荷葉堿含量的多重比較表（SSR法）Table5 Multiple comparisons table of the rate of nuciferine contentof lotus leaf in the differentgrowing periods(SSR)

相同字母表示兩者間差異不顯著，不同字母表示兩者間差異顯著。

類型 平均數(shù)/(mg·g-1) 差異顯著性α=0.05 α=0.01 8月中旬9月中旬10月中旬11月中旬7月中旬6月中旬5月中旬2.132 2.119 1.934 1.866 1.838 1.194 1.084 aaaaabb AAAAABB

3 結(jié)論

荷葉在不同生長期總黃酮和荷葉堿含量存在差異。荷葉從生長到干枯的過程中，內(nèi)部黃酮的含量是隨著生長不斷上升，在8月份達(dá)到最大值84.21 mg/g；荷葉進(jìn)入衰亡期后，內(nèi)部黃酮含量又迅速下降。荷葉堿的含量也是先上升后下降的趨勢。營養(yǎng)生長期時(shí)，荷葉內(nèi)部的荷葉堿含量迅速增加，荷葉成熟時(shí)荷葉堿含量達(dá)到了最大值2.132mg/g；進(jìn)入衰亡期后，荷葉堿物質(zhì)也慢慢流失。

康璇等[14]以安徽的干荷葉為材料，用乙醇熱提法提取荷葉總黃酮，最高含量為22.3 mg/g，比本試驗(yàn)8月份荷葉總黃酮含量低很多，說明超聲輔助提取法比熱提法效果好；荷葉總黃酮的含量可能與荷葉的產(chǎn)地也有關(guān)，這有待今后進(jìn)一步研究。另外荷葉的質(zhì)量與水質(zhì)、土壤、氣候等環(huán)境因素及內(nèi)在的遺傳機(jī)制也有關(guān)；荷葉中的有效成分的形成和積累與其生態(tài)環(huán)境也息息相關(guān)[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，荷葉中總黃酮和荷葉堿的含量均在成熟期時(shí)達(dá)到最大值，兩者變化規(guī)律的機(jī)理和兩者變化之間的聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。

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