康紹英 周興旺 張繼紅 楊代明

KANG Shao-ying ZHOU Xing-wang ZHANG Ji-hong YANG Dai-ming

（湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410007）

(Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research，Changsha，Hunan 410007，China)

黃曲霉毒素是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌代謝產(chǎn)生的一類有毒的真菌毒素[1,2]，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。黃曲霉毒素存在于土壤、動植物、各種堅果，特別是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、調(diào)味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。目前發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素有20 多個種類，其中以黃曲霉毒素 B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)4種最為常見，而黃曲霉毒素B1又最為多見，其毒性和致癌性也最強，毒性大于氰化鉀[3]。1993年黃曲霉素B1被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物[4]，受到世界各國的廣泛關(guān)注。歐盟在98/53/EC指令中規(guī)定了人類直接食用的花生中黃曲霉毒素的限量為黃曲霉B1小于 2 μg/kg，黃曲霉 B1、B2、G1、G2總量小于 4 μg/kg[5]。中國對食品中黃曲霉毒素也制定了嚴(yán)格的限量規(guī)定[6]。

目前黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)[7-9]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[7,10]、微柱法[8]、免疫親和柱—熒光分光光度法[11]、液相色譜法(HPLC)[1,8,11-12]等。TLC雖然分析成本較低，但操作繁瑣、耗時長、污染大、定量差、靈敏度差[13]；ELISA雖操作簡單、靈敏度高，但特異性差、重復(fù)性差，易出現(xiàn)假陽性[14]。HPLC因其高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點而得到越來越廣泛的應(yīng)用，HPLC通常使用熒光檢測器，樣品經(jīng)226多功能凈化柱或免疫親和柱凈化后，還需要在柱前或柱后進行衍生，樣品處理煩瑣、操作復(fù)雜；本方法擬采用免疫親和柱凈化、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中的黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2，因為該方法目標(biāo)分析物無需衍生可直接測定，能夠顯著的提高結(jié)果準(zhǔn)確性，且大大縮減了樣品前處理時間，此方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠，本研究旨在尋求食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2測定的理想方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

TSQ Quantum三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Thermo TSQ Ultra AM，賽默飛世爾科技 Thermo Fisher Scientific公司，配有電噴霧電離源（ESI）；

負(fù)壓固相萃取裝置：天津博納艾杰爾科技有限公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：KYC-1102C型，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D（Ш）型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

電子分析天平：BS224S型，賽多利斯（北京）儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 試劑

黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（苯—乙腈(98+2)溶液）：1 mL，黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2濃度分別為 1.055，0.327，1.082，0.309 μg/mL，SUPELCO Analytical USA。

甲醇：HPLC，Productof Tedia,United States of America;

氯化鈉、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

基準(zhǔn)值[34-42]指未受人類活動影響，反映土壤原始沉積環(huán)境(第Ⅰ環(huán)境)的地球化學(xué)元素含量，也就是自然條件下的地球化學(xué)背景情況，又稱土壤元素本底值，用深層土壤地球化學(xué)元素含量表征。其控制因素主要是地質(zhì)背景、沉積物來源等。它是研究表生元素地球化學(xué)行為的重要參比值，也是評判表層土壤“污染程度”的重要依據(jù)，是評價土壤元素豐缺、成土母質(zhì)環(huán)境質(zhì)量、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與安全性及防治對策等研究的參考值。

磷酸二氫鉀：分析純，天津森潤生物技術(shù)有限公司；

甲酸：分析純，重慶川東化工（集團）有限公司化學(xué)試劑廠；

乙酸銨：分析純，西隴化工股份有限公司；

甲醇—水(7+3)：取70mL甲醇加30mL水；

甲醇—水(8+2)：取80mL甲醇加20mL水；

pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液：取25.0mL 0.2 mol/L的磷酸二氫鉀溶液與29.1mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100mL。

1.3 方法

1.3.1 提取

(1)大米、玉米、小麥、花生及其制品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過磨細(xì)(粒度小于2mm)的試樣10 g于150mL具塞錐形瓶中，加入2 g氯化鈉及50 mL甲醇—水(7+3)，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩提取30min，定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取2 mL濾液并加入4mL水稀釋，備用。

(2)植物油脂：準(zhǔn)確稱取試樣10 g于150mL具塞錐形瓶中，加入2 g氯化鈉及50 mL甲醇—水(7+3)，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩提取30min，定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取2mL濾液并加入4mL水稀釋，備用。

(3)醬油：準(zhǔn)確稱取試樣10 g于100mL具塞比色管中，加入2 g氯化鈉及甲醇—水(8+2)至100 mL，混勻，定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取2mL濾液并加入4mL水稀釋，備用。

(4)食醋：準(zhǔn)確稱取5 g樣品，加入1 g氯化鈉，以pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25mL，混勻，定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取2mL濾液并加入4mL水稀釋，備用。

1.3.2 凈化 將免疫親和柱連接于10 mL塑料注射器下并將其連接在固相萃取裝置上。將樣品提取液的稀釋液注入注射器中，將真空泵與固相萃取裝置連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3mL空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2～3 mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1mL色譜級甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min，收集全部洗脫液于尖底刻度試管中，供檢測用。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18柱 (150 mm×2.1mm，3 μm)；流速：200 μL/min；進樣量：5 μL；流動相：A為甲醇，B為含0.1%甲酸和5mM乙酸銨的水溶液。梯度洗脫條件：0～0.5 min，20%A；0.5～3min，20%～90%A；3～7min，90%A；7～7.1min，90%～20%A；7.1～10min，20%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；噴霧電壓：3 kV；離子源溫度：300℃；毛細(xì)管溫度：350 ℃；鞘氣壓力：300 kPa；掃氣流速：0 L/min；輔助氣流速：5 L/min；氮氣作為鞘氣和輔助氣，氬氣作為碰撞氣，碰撞壓力：0.2 Pa，黃曲霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)（定性離子對、定量離子對、碰撞能量、去簇電壓和Tube lens）見表1。

表1 黃曲霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table1 Mass spectrometric parametersofaflatoxin

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

黃曲霉毒素是中等極性的物質(zhì)，所以適合用電噴霧離子源進行離子化。試驗中嘗試了分別采用正、負(fù)兩種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效率明顯高于負(fù)離子模式。在全掃描模式下，確定了M+H作為4種黃曲霉毒素的母離子，通過直接注射進樣方式調(diào)諧，對黃曲霉毒素質(zhì)譜檢測的噴霧電壓、離子源溫度、鞘氣壓力、輔助氣壓力、毛細(xì)管溫度等參數(shù)進行優(yōu)化，最終選定噴霧電壓為3 kV、離子源溫度為300℃、鞘氣壓力為300 kPa、輔助氣壓力為5 L/min、毛細(xì)管溫度為350℃。在此基礎(chǔ)上分別對每種黃曲霉毒素進行子離子掃描并優(yōu)化各子離子的碰撞能量、去簇電壓、Tube lens，優(yōu)化結(jié)果見表1。子離子掃描時，每種黃曲霉毒素選擇兩個響應(yīng)較強的子離子作為檢測的碎片離子，其中豐度高而且穩(wěn)定的離子做定量離子，最終確定了質(zhì)荷比(m/z)為241.071，259.066，243.087，245.000 的子離子分別做黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的定量離子。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對于液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，流動相的選擇不僅要考慮色譜系統(tǒng)的洗脫能力，而且還需考慮各組分在質(zhì)譜中的離子化效率。由于黃曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，本試驗分別采用甲醇、乙腈與水混合做流動相。預(yù)試驗證明，雖然乙腈在液相中的洗脫效果比甲醇好，但是其離子化程度明顯受到抑制，離子豐度明顯降低，導(dǎo)致靈敏度下降，說明乙腈的離子化效率低，所以采用了甲醇作為流動相。為了促進樣品的離子化達到最優(yōu)靈敏度，本試驗考察了水相中分別加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸、5mM乙酸銨—0.1%甲酸混合溶液，同一濃度的各種黃曲霉毒素的峰面積數(shù)據(jù)見表2，結(jié)果表明：加入5mM乙酸銨—0.1%甲酸時得到最優(yōu)的靈敏度，因此最終確定流動相條件為甲醇—0.1%甲酸和5 mM乙酸銨的水溶液的梯度洗脫，4種黃曲霉毒素在6min內(nèi)得到了最佳的分離效果，黃曲霉毒 素 B1、B2、G1、G2的 保 留 時 間 分 別 為 5.90，5.80，5.67，5.53min，黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品選擇性離子色譜圖見圖1。

2.3 凈化小柱的選擇

表2 流動相組成對黃曲霉毒素峰面積的影響Table2 Effectson aflatoxin peak areaof mobilephase composition

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品選擇性離子色譜圖Figure1 Selective ion chromatograms foraflatoxin B1,B2,G1,G2 standard

目前黃曲霉毒素的凈化小柱主要有多功能凈化柱和免疫親和柱。多功能凈化柱的凈化原理是采取多重復(fù)合填料吸附脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)，而黃曲霉毒素不被吸附，從而使樣液得到凈化。雖然其凈化速度快，但由于其特異性不強，不能完全排除雜質(zhì)干擾，尤其影響低含量黃曲霉毒素的測定。本方法選擇含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上，使其與其他雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等)分離，然后用水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，最后用甲醇將黃曲霉毒素洗脫下來。由于抗原—抗體反應(yīng)只能特異性地、高選擇性地吸附黃曲霉毒素，而讓其他雜質(zhì)通過柱子，可將凈化、濃縮一步完成，大大簡化了前處理過程，提高了檢測靈敏度，因此是一種高效、靈敏、準(zhǔn)確、易于推廣的目前最為先進的一種凈化方法。本方法比較了美國Romer公司Mycosep 226多功能凈化柱和美國VICAM公司免疫親和柱兩種商品化小柱的凈化效果（圖2和圖3）。比較兩個色譜圖可以看出，圖3在濃縮一倍的情況下比圖2的基線噪音還要低，且有效的去除了干擾目標(biāo)分析物檢測的雜質(zhì)。

圖2 多功能凈化柱凈化樣品的選擇性離子色譜圖Figure 2 Selective ion chromatograms for sample purified bymultifunctional cleanup column

圖3 免疫親和柱凈化樣品的選擇性離子色譜圖Figure 3 Selective ion chromatograms for sample purified by immunoaffinity chromatography

2.4 線性范圍與檢測限

將黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇逐級稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列，分別進樣5μL，以色譜峰面積y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度x為橫坐標(biāo)對測定結(jié)果進行線性回歸，線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限見表3。

2.5 回收率和精密度

選取花生醬、食用油和醬油三類典型樣品，在空白樣中添加表4中所列的3組濃度水平的黃曲霉毒素，按上述試驗條件進行加標(biāo)回收試驗，每個水平進行6次平行測定，測得的回收率和精密度結(jié)果見表4。從表4中的回收率及精密度可以看出，平均加標(biāo)回收率在80.6%～100.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～7.5%，滿足試驗要求。

表3 黃曲霉毒素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限Table3 Linear range,regression equation,correlation coefficientand LOD ofAflatoxin

2.6 方法驗證

運用本試驗建立的方法，對在風(fēng)險監(jiān)控中檢測出的部分陽性樣品分別采用液相色譜—熒光法和質(zhì)譜法兩種方法檢測，兩種方法比對數(shù)據(jù)見表5。比較兩種方法檢測結(jié)果表明，該方法檢測結(jié)果完全符合要求。

3 結(jié)論

目前，現(xiàn)行有效的測定食品中黃曲霉毒素的的國標(biāo)檢測方法有5個，涉及薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、微柱法、熒光分光光度法、液相色譜法，而至今中國尚未出臺黃曲霉毒素的質(zhì)譜檢測法國家標(biāo)準(zhǔn)。與上述方法相比較，本法采用免疫親和柱凈化樣品，用高效液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品，主要優(yōu)勢在于目標(biāo)分析物無需衍生可直接測定，縮減了樣品前處理時間，顯著提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測的靈敏度，又減少了檢測的假陽性現(xiàn)象，此方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠，有較強的實用性，是食品中的黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2測定的理想選擇方法，有望在將來作為黃曲霉毒素檢測的國標(biāo)檢測方法推行。

1 鮑蕾,劉心同,張藝兵,等.多功能凈化柱高效液相色譜法檢測花生中的黃曲霉毒素[J].檢驗檢疫科學(xué),2005,15(5):23～25.

表4 回收率和精密度試驗Table4 Recovery and the precision test(n=6)

表5 兩種方法比對結(jié)果Table5 Comparison resultsof twomethods/(μg·kg-1)

2 魏麗莉.黃曲霉毒素對食品的污染及防治措施[J].糧油加工,2008(9):86～89.

3 IARCWorking Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.Some naturally occurring substances:Food items and constituents,heterocyclic aromatic amines,and mycotoxins[M].Lyon:World Health Organization,International Agency for Research on Cancer,1993.

4 張藝兵,鮑蕾,褚慶華.農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測分析[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

5 王晶,王林.食品安全快速檢測技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:90～110.

6 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2761——2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011.

7 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.22——2003食品中黃曲霉毒素B1的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

8 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.23——2006食品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.

9 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5009.24——2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

10 余以剛,邱楊,吳暉,李曉鳳,劉冬梅.幾種傳統(tǒng)食品中黃曲霉毒素B1的檢測與安全評價[J].食品與機械,2007,23(4):110～111.

11 北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB/T 18979——2003食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

12 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 23212——2008 牛奶和奶粉中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2的測定液相色譜—熒光檢測法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

13 尚瑛達,曹素芳.薄層色譜法測定黃曲霉素B1探討[J].糧食與油脂,1993(4):50～51.

14 田素梅.糧食中酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素探討[J].糧油倉儲科技通訊,2012(1):53～56.