邱 嵐 高健強(qiáng)

QIU Lan GAO Jian-qiang

（銅仁學(xué)院生物科學(xué)與化學(xué)系梵凈山特色動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 銅仁 554300）

(Guizhou Tongren College,The Key Laboratory of Characteristic Animal and Plant Resources of Fanjing Mountain,Tongren,Guizhou 554300,China)

大豆蛋白質(zhì)是空間結(jié)構(gòu)緊密、二硫鍵構(gòu)架牢固的蛋白，酶分子難以打開(kāi)其表面結(jié)構(gòu)，不能進(jìn)入蛋白分子內(nèi)部，使得水解反應(yīng)難以進(jìn)行，從而導(dǎo)致大豆酶解產(chǎn)肽率相對(duì)較低[1]。對(duì)大豆蛋白功能性質(zhì)進(jìn)行改善是大豆蛋白分離(SPI)研究的熱點(diǎn)，目前大豆分離蛋白分離技術(shù)有生物技術(shù)、物理技術(shù)、化學(xué)技術(shù)和復(fù)合技術(shù)[2]。機(jī)械力化學(xué)反應(yīng)作為一種機(jī)械處理的物理化學(xué)方法，是近年來(lái)的一個(gè)新技術(shù)。機(jī)械力化學(xué)也是化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)分支,它是粉碎技術(shù)不斷深入發(fā)展的產(chǎn)物[3]。近年來(lái),機(jī)械力化學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)非金屬材料和金屬材料加工領(lǐng)域[4]。機(jī)械力化學(xué)反應(yīng)是固體物質(zhì)在各種形式的機(jī)械能作用下所激發(fā)的化學(xué)變化和物理化學(xué)變化，以此來(lái)制備新材料或?qū)Σ牧线M(jìn)行改性處理[5，6]。物料經(jīng)機(jī)械化學(xué)應(yīng)力的作用，可對(duì)某些天然生物資源的理化性能、功能特性和食用特性產(chǎn)生多方面的影響[7]。研究機(jī)械化學(xué)反應(yīng)力作用對(duì)提高大豆分離蛋白產(chǎn)率具用實(shí)際意義。

前人[8～10]在軟飲料加工和中草藥制備改性應(yīng)用中研究機(jī)械化學(xué)反應(yīng)力的應(yīng)用的比較多。目前，利用機(jī)械化學(xué)反應(yīng)力技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的軟飲料和中草藥有：豆類固體飲料[11]、粉茶[12]、魔芋保健粉[13]、復(fù)方貝母散[14]等。經(jīng)過(guò)機(jī)械化學(xué)反應(yīng)加工制備后的物料，具有小粒徑、大比表面積，在物理、化學(xué)等反應(yīng)過(guò)程中，大大增加了反應(yīng)接觸的面積，進(jìn)而提高了有效的成分提取和浸提過(guò)程的化學(xué)反應(yīng)速率，生產(chǎn)過(guò)程既節(jié)約時(shí)間又提高效率[15～17]。因此，通過(guò)機(jī)械化學(xué)應(yīng)力作用改變大豆分離蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)，在大豆分離蛋白降解中應(yīng)用，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高溫脫脂大豆粕：蛋白質(zhì)47.346%，水分9.464%，脂肪0.429%，灰分3.957%，市售；

HCl:分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

NaOH:分析純，華東醫(yī)藥試劑有限公司；

純水、蒸餾水：實(shí)驗(yàn)室Millipore純水機(jī)自制。

1.2 儀器與設(shè)備

扁平式超音速氣流粉碎系統(tǒng)：QLFS-100型，常州市益球中亞干燥設(shè)備廠；

粉碎機(jī):RT-300型,榮聰精密科技有限公司;

微粉機(jī):BFM-T6BI型,濟(jì)南貝利粉碎技術(shù)工程有限公司;

恒溫磁力攪拌器:79-1型,江蘇國(guó)勝電器有限公司;

分析天平：HR-200型，上海方瑞儀器有限公司；

離心機(jī)：CR-21G型，日立工機(jī)株式會(huì)社；

恒溫水浴鍋：HH.S21-4型，上海百典儀器設(shè)備有限公司；

pH計(jì)：PHS-3E型，上海雷磁有限公司；

分光光度計(jì)：U-2010型，日立工機(jī)株式會(huì)社；

測(cè)量顯微鏡：107JPC型，上海光學(xué)儀器廠；

凱氏定氮儀：2100型，瑞典FOSS公司；

恒溫水浴振蕩器：SHAB型，金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；

激光粒度分析儀：BT-9300H型，丹東百特科技有限公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-6301F型，日本JEOL公司。

1.3 試驗(yàn)方法

機(jī)械力化學(xué)方法制備大豆粉體的方法：取高溫大豆粕,在50～60℃下干燥，進(jìn)行不同粉碎程度的處理，得到以下3種不同粒度的荷葉樣品,備用。試驗(yàn)分為3個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)。

(1)樣品1：干燥的粗樣品經(jīng)取一定量高溫大豆粕用RT靜音粉碎機(jī)粉碎,過(guò)180μm篩,得到的粉體稱為粗粉；

(2)樣品2：對(duì)樣品1在QLM扁平式超音速氣流粉碎系統(tǒng)粉碎至中位徑D50=30μm；

(3)樣品3：對(duì)樣品1在BFM-T6BI“貝利”微粉機(jī)粉碎至中位徑D50=10μm。

大豆分離蛋白采取堿溶酸沉法工藝[18,19]：

高溫脫脂豆粕→清理→一次堿溶→二次堿溶→固液分離→酸沉→離心分離→酸堿調(diào)節(jié)→濃縮→濃縮干燥

具體提取方法步驟[20]：第一次堿溶料液比1∶12(m∶V)，浸提液濃度1mol/LNaOH，調(diào)pH值至9.0，攪拌15min，靜置30min；第二次堿溶料液比1∶8(m∶V)，浸提液濃度1mol/L NaOH，調(diào) pH值至 9.0，攪拌 15min，靜置 30min；酸沉，浸提液濃度1mol/LHCl，調(diào)pH值4.5，停止攪拌，靜置30min。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 粉體特性 取樣品適量，加一定量無(wú)水乙醇分散，用滴管移取少量于裝有無(wú)水乙醇比色皿中，置BT-9300H型激光粒度分布儀測(cè)定粒徑分布及比表面積；JCM-6000 Neo－Scope臺(tái)式掃描電子顯微鏡用于大豆蛋白粉顆粒表面形貌表征，分別取3種粉體各少許鋪于掃描電鏡樣品臺(tái)上，噴金鍍膜后觀察不同粒徑分布紅花粉體的結(jié)構(gòu)及表面形態(tài)。

1.4.2 化學(xué)分析

(1)高溫大豆粕蛋白成分測(cè)定分別按照GB/T 5009.6——2003、GB/T 5009.3——2010、GB/T 5009.5——2010、GB/T 5009.4——2010的方法分別測(cè)定其蛋白質(zhì)、脂肪、水分和灰分的含量。

(2)分離蛋白測(cè)定：按照GB/T 5009.6——2003測(cè)定最終提取液中的蛋白含量。按式(1)計(jì)算分離蛋白（SPI）提取率。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)計(jì)算與處理、相關(guān)分析用Origin 8.0與Microsoft Office Excel 2003軟件進(jìn)行；方差分析和多重比較采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白粉粒度分析

粒度或粒徑表示顆粒的大小，通常是以單個(gè)顆粒為對(duì)象，而一堆粉體所涉及的并非單個(gè)顆粒，包含不同粒徑的若干顆粒的集合體，即顆粒群。粒度分布就是以顆粒群為對(duì)象，表示該粒群中所有顆粒在一定粒度范圍內(nèi)的分布特征，它反映了各種顆粒大小及對(duì)應(yīng)的數(shù)量關(guān)系[21]。粒度分布范圍的不同造成顆粒群的物理化學(xué)性質(zhì)也不同。用BT-9300H激光粒度分析儀測(cè)定3個(gè)樣品的粒度分布，得出3個(gè)樣品粉體粒度分布曲線見(jiàn)圖1～3。

圖1 樣品1激光粒度分布Figure 1 Particle size distribution of Sample 1

圖2 樣品2激光粒度分布Figure 2 Particle size distribution of Sample 2

測(cè)定粉體的粒徑，樣品1的D90為274.54μm，D50為158.00μm；經(jīng)過(guò)機(jī)械力化學(xué)處理的樣品2的D90為26.79μm，D50為10.03μm；樣品3的D90為10.45μm，D50為3.97μm。3種粉體的分布結(jié)果見(jiàn)圖1～3。通過(guò)激光粒度分布儀分析可知，隨著機(jī)械力化學(xué)作用方式的改變，大豆分離蛋白的中位徑、體積平均徑、面積平均徑逐漸減小，比表面積逐漸增大。出現(xiàn)上述原因主要是因?yàn)闅饬髌扑樵碇饕且揽扛咚贇饬魇沽戏叟c料粉、料粉與內(nèi)壁之間的產(chǎn)生強(qiáng)碰撞而達(dá)到破碎的效果；而震動(dòng)粉碎的原理是物料由加料斗進(jìn)入粉碎室，經(jīng)振動(dòng)將粉碎室內(nèi)的研磨棒與物料碰撞、研磨而獲得粉碎，該機(jī)配有水冷裝置，可控制粉碎室內(nèi)的溫度。由于大豆蛋白屬于有機(jī)態(tài)，富含脂肪，同樣研磨時(shí)間，氣流粉碎的效果相對(duì)振動(dòng)粉碎效果偏弱一些。

圖3 樣品3激光粒度分布Figure 3 Particle size distribution of Sample 3

2.2 大豆蛋白粉的顆粒性貌分析

顆粒表面形貌對(duì)顆粒群的物理和化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生諸多影響，如顆粒的比表面積、分散性、化學(xué)活性等[22]。取3種粉體少許，用適當(dāng)溶媒分散，滴取樣后自然干燥，黏臺(tái)噴金，利用電子顯微鏡對(duì)4個(gè)樣品進(jìn)行表面形貌觀察，用臺(tái)式掃描電子顯微鏡對(duì)3種大豆蛋白粉顆粒表面形貌表征如圖4～6。

圖4 樣品1掃描電鏡照片（1 000倍）Figure 4 SEM micrographs of Sample 1

圖5 樣品2掃描電鏡照片（1 000倍）Figure 5 SEM micrographs of Sample 2

圖6 樣品3掃描電鏡照片（1 000倍）Figure 6 SEM micrographs of Sample 3

由圖4可知，樣品1粉體顆粒粒徑普遍偏大，顆粒大小形狀分布不均勻，表面無(wú)裂痕，結(jié)構(gòu)緊密，有明顯的斷口塊狀結(jié)構(gòu)；由圖5可知，樣品2與樣品1相比，隨著顆粒粒徑減少結(jié)構(gòu)更加緊密；由圖6可知，樣品3顆粒粒徑偏小，顆粒表面較粗糙,且顆粒大小形狀分布均勻，結(jié)構(gòu)普遍松散，呈碎屑狀，無(wú)明顯的斷口。隨著顆粒粒徑減小，比表面積增大，表面破損程度越嚴(yán)重，內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有效成分越容易析出。與樣品1相比，樣品2和樣品3經(jīng)機(jī)械力化學(xué)處理后，粒徑分布更加均勻，粉體粒徑更小，比表面積也就越大。其特有的特征，如纖維性、晶型等均會(huì)失去。由圖5可知，過(guò)180μm篩的大豆蛋白粉在放大1 000倍的電鏡下仍可觀察到較完整的植物組織結(jié)構(gòu)，大部分細(xì)胞未被破碎。而經(jīng)機(jī)械化學(xué)處理后，在放大1 000倍的電鏡下已觀察不到完整細(xì)胞，樣品2的D90為26.79μm，樣品3的D90為10.45μm，豆粕細(xì)胞可能已被充分破碎，細(xì)胞內(nèi)的成分被暴露出來(lái)，呈釋放狀態(tài)。由此可知，顆粒粒徑減小，比表面積增大，在機(jī)械力化學(xué)作用下造成細(xì)胞破碎而有利于大豆分離蛋白的溶出。

2.3 機(jī)械化學(xué)反應(yīng)力對(duì)大豆蛋白分離的影響

機(jī)械力化學(xué)處理的機(jī)械力作用將會(huì)導(dǎo)致不同粒徑顆粒化學(xué)成分的不同[23]。不同粒徑當(dāng)大豆蛋白粉的粗蛋白含量與蛋白質(zhì)的溶解率詳見(jiàn)表1。由表1可知，樣品2和樣品3大豆蛋白粉中的蛋白質(zhì)浸出率分別比樣品1提高47.6%、82%，與樣品1大豆蛋白粉體中蛋白質(zhì)的浸出率相比差異顯著。大豆蛋白粉體粒度越小，蛋白質(zhì)的溶解率越高。特別是當(dāng)粒徑D50為30μm時(shí)，其溶解率顯著提高，而顆粒粒徑D50為10μm時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解率最高為65.91%。由表1還可以得出，樣品2及樣品3豆粕組大豆分離蛋白的提取率兩者差異極顯著，樣品2及樣品3豆粕組分離蛋白中蛋白的含量無(wú)顯著差異。可見(jiàn)，不同的粒徑分布可顯著提高大豆分離蛋白的提取率，但是對(duì)其粗蛋白含量提高無(wú)差異。

表1 機(jī)械化學(xué)處理對(duì)SPI提取率及蛋白含量的影響覮Table1 Effectof SPIand protein contentof Mechanical-chemical /%

4 結(jié)論與討論

一方面由于機(jī)械力化學(xué)作用，經(jīng)機(jī)械力化學(xué)處理后的豆粕，顆粒粒徑減小，比表面積增大，豆粕細(xì)胞可能已被充分破碎，細(xì)胞內(nèi)的成分被暴露出來(lái)，呈釋放狀態(tài)。由此可知，在機(jī)械力化學(xué)作用下造成細(xì)胞破碎而有利于大豆分離蛋白的溶出。另一方面樣品2及樣品3豆粕組大豆分離蛋白的提取率分別為53.46%和65.91%，兩者差異極顯著，樣品2及樣品3豆粕組分離蛋白中蛋白的含量分別為78.79%和79.78%。可見(jiàn)，不同的粒徑分布可顯著提高大豆分離蛋白的提取率，但是對(duì)其粗蛋白含量提高無(wú)差異。

目前，機(jī)械力化學(xué)處理可選擇的設(shè)備普遍很多，常見(jiàn)的機(jī)械力化學(xué)處理設(shè)備有振動(dòng)磨、氣流粉碎系統(tǒng)、球磨機(jī)、攪拌磨、沖擊式粉碎機(jī)等多種類型[24]。試驗(yàn)對(duì)QLM扁平式超音速氣流粉碎系統(tǒng)與BFM-T6BI貝利振動(dòng)粉碎機(jī)進(jìn)行了比較分析試驗(yàn)，結(jié)果表明，以BFM-T6BI貝利振動(dòng)粉碎機(jī)效果最好，相同粉碎時(shí)間，粉體粒徑普遍較小，細(xì)胞破壞嚴(yán)重，可控制溫度，有效成分的溶出率高。

1893年Lea最早進(jìn)行機(jī)械力化學(xué)試驗(yàn)[4]。1951年P(guān)eters和Cremer對(duì)機(jī)械力化學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，Peters發(fā)表《機(jī)械力化學(xué)反應(yīng)》的論文,指出能觀察到研磨過(guò)程中各種固態(tài)反應(yīng)，從而機(jī)械力化學(xué)引起了全世界廣泛的關(guān)注[25]。機(jī)械化學(xué)反應(yīng)作為一種機(jī)械處理的物理化學(xué)方法，是近年來(lái)的一個(gè)新技術(shù)。是化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)分支,也是粉碎技術(shù)不斷深入發(fā)展的邊緣學(xué)科。近年來(lái),機(jī)械力化學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)非金屬材料和金屬材料加工領(lǐng)域。機(jī)械力化學(xué)反應(yīng)是固體物質(zhì)在各種形式的機(jī)械能作用下所激發(fā)的化學(xué)變化和物理化學(xué)變化,以此來(lái)制備新材料或?qū)Σ牧线M(jìn)行改性處理。物料經(jīng)機(jī)械化學(xué)應(yīng)力的作用，可對(duì)某些天然生物資源的理化性能、功能特性和食用特性產(chǎn)生多方面的影響。食品經(jīng)機(jī)械力化學(xué)處理，可使粉體粒徑減小，具有極大的比表面積，粗糙程度增加，細(xì)胞破壁率提高，在生物、化學(xué)等反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)接觸的面積大大增加了，從而提高了有效成分的溶出率，且對(duì)有效成分改性，易于有效成分在人體吸收利用[26]。但機(jī)械力化學(xué)處理技術(shù)在食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用也屬于起步階段，仍存在一些亟待解決的問(wèn)題。食品經(jīng)過(guò)機(jī)械化學(xué)反應(yīng)力處理后的原料，可以提高發(fā)酵、酶解過(guò)程的化學(xué)反應(yīng)速度，生產(chǎn)中節(jié)約了時(shí)間，提高了效率。因此，通過(guò)機(jī)械化學(xué)應(yīng)力作用改變大豆分離蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)，在大豆分離蛋白降解中應(yīng)用，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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