吳建陽(yáng) 李彩琴等

摘 要： 【目的】為了探明荔枝ACC氧化酶（ACO）基因與荔枝幼果脫落的關(guān)系，【方法】用RT-PCR和RACE擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行ACO基因的克??；在‘黑葉荔枝花后30 d噴施100 mg·L-1萘乙酸（NAA）來(lái)進(jìn)行荔枝幼果落果的處理；用熒光定量PCR技術(shù)分析ACO基因表達(dá)與荔枝幼果脫落的關(guān)系。【結(jié)果】首次從荔枝中分離得到ACO基因，并命名為L(zhǎng)c-ACO1。Lc-ACO1全長(zhǎng)為1 231 bp，其中5′非編碼區(qū)包含89 bp，3′非編碼區(qū)包含215 bp，開(kāi)放閱讀框包含927 bp，編碼309個(gè)氨基酸。Lc-ACO1基因含有ACO基因特有的7個(gè)保守區(qū)和9個(gè)不變氨基酸殘基。100 mg·L-1萘乙酸（NAA）可以顯著促進(jìn)荔枝幼果的脫落，且處理后相對(duì)落果率高峰出現(xiàn)在第10天，而Lc-ACO1基因在離區(qū)和幼果中的表達(dá)量高峰都出現(xiàn)在第7天，基因表達(dá)量高峰比相對(duì)落果率高峰早出現(xiàn)3 d?！窘Y(jié)論】Lc-ACO1基因可能與荔枝幼果的脫落密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 荔枝； ACC氧化酶； 基因； 克?。?表達(dá)； 落果

中圖分類號(hào)：S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）屬于無(wú)患子科（Sapindaceae）荔枝屬（Litchi）原產(chǎn)于我國(guó)南部，主產(chǎn)區(qū)主要分布在廣東、廣西、福建、海南、臺(tái)灣等省區(qū)。中國(guó)大陸各省份中廣東省種植面積最大。荔枝的落果非常嚴(yán)重，是限制荔枝產(chǎn)量的主要因子。

器官脫落是植物界普遍發(fā)生的生理現(xiàn)象，不論是花器中的花瓣、萼片、雄蕊、花冠，還是植物的葉片、成熟或未成熟的果實(shí)等都會(huì)發(fā)生脫落。脫落是一種由各種因素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜生理過(guò)程，多種激素對(duì)其都有影響，其中乙烯被認(rèn)為是促進(jìn)脫落的效應(yīng)劑，許多實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)源乙烯水平與脫落正相關(guān)。植物體內(nèi)乙烯生物合成的途徑為：MET（甲硫氨酸）→SAM（腺苷甲硫氨酸）→ACC（l-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）→乙烯，其中ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）是乙烯生物合成途徑中最后一個(gè)酶、也是最關(guān)鍵的一個(gè)限速步驟、催化ACC轉(zhuǎn)化成乙烯，控制ACO基因的表達(dá)能有效地控制乙烯的生物合成[1]。橄欖中OeACO2基因的表達(dá)隨著成熟橄欖脫落的發(fā)生而不斷增強(qiáng)[2]在蘋果幼果自然脫落過(guò)程中，MdACO1和MdACO2基因在脫落果的果皮中大量表達(dá)[3]；Li等[4]對(duì)蘋果采前落果的研究表明MdACO1的表達(dá)模式具有品種差異，在易發(fā)生采前落果的‘Golden Delicious品種的果皮和離區(qū)中，MdACO1基因的表達(dá)都上調(diào)，而在無(wú)采前落果的‘Fuji品種中MdACO1基因表達(dá)的增強(qiáng)只發(fā)生在果皮中；進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)在乙烯利誘導(dǎo)蘋果幼果脫落過(guò)程中也表現(xiàn)出MdACO1基因表達(dá)的增強(qiáng)[5]。在臍橙中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，乙烯利處理促進(jìn)CsACO基因在臍橙葉柄離區(qū)和成熟果柄離區(qū)中的表達(dá)，1-MCP處理則抑制了該基因的表達(dá)[6]。但至今未見(jiàn)有關(guān)荔枝中ACO基因克隆、表達(dá)及其與果實(shí)脫落相關(guān)的報(bào)道，因此本研究通過(guò)克隆荔枝ACO基因，并分析其在荔枝幼果落果過(guò)程中的表達(dá)變化，來(lái)揭示ACO基因與荔枝幼果落果之間的關(guān)系，為調(diào)控荔枝落果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

2009年3月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)荔枝園選取長(zhǎng)勢(shì)中庸的10 a生‘黑葉荔枝2株，其中1株用來(lái)整株噴施100 mg·L-1 NAA，另一株用作對(duì)照。在花后30 d進(jìn)行田間處理，處理前先在對(duì)照樹(shù)和處理樹(shù)上的東南西北方向各挑選15條粗度近似的結(jié)果母枝進(jìn)行掛牌，每5條為一個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)處理重復(fù)3次。掛牌后記錄其果穗上的幼果數(shù)并做好標(biāo)記，每次取樣前都要記錄其果穗上的果實(shí)數(shù)。取樣時(shí)間為處理后0、3、7、10 d。取樣后用冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，將離區(qū)和果實(shí)分開(kāi)（在果柄離層部位上下0.2 cm進(jìn)行離區(qū)材料的切?。靡旱賰龊蟠娣庞?80 ℃冰箱中備用。

荔枝相對(duì)落果率的計(jì)算公式如下：

相對(duì)落果率（%）=×100（1）

Mt和Mt+d分別代表t時(shí)期和t+d時(shí)期坐果的數(shù)量。

1.2 荔枝離層總RNA的提取及其質(zhì)量檢測(cè)

荔枝離區(qū)和幼果總RNA的提取參照吳建陽(yáng)等[7]進(jìn)行。提取RNA后立即進(jìn)行DNA的消化，然后利用紫外分光光度計(jì)（UV2501，島津，日本）測(cè)定總RNA樣品在260 nm和280 nm處的吸光值，以評(píng)價(jià)總RNA的純度并計(jì)算其濃度，進(jìn)一步在甲醛變性瓊脂糖凝膠和MOPS緩沖液中電泳檢測(cè)，以確定總RNA的質(zhì)量。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

按照GenBank中登錄的已知ACO基因氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 cDNA克隆

把荔枝離區(qū)和幼果的總RNA混合后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用合成的cDNA為模板與ACO基因的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃，3 min，1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94 ℃、30 s；57 ℃、30 s；72 ℃、1 min），循環(huán)完畢后，72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，切下目的片段，經(jīng)回收純化后與pMD 20-T（TaKaRa，日本）載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α（TaKaRa，日本），涂布于含X-gal和IPTG并具氨芐青霉素（Amp）抗性的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，然后隨機(jī)挑選經(jīng)EcoRI/HindIII雙酶切（TaKaRa，日本）確認(rèn)已插入的質(zhì)粒作序列分析。測(cè)序工作委托上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，采用ABI3730（ABI，美國(guó)）序列分析儀。在獲得ACO1基因片段后，根據(jù)其cDNA片段的3′和5′端附近序列分別設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）擴(kuò)增，所用試劑為3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa，日本）和5′-Full RACE Kit（TaKaRa，日本）試劑盒，并按照說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行操作。

1.5 序列分析

利用ExPASy在線翻譯工具（http：//cn.expasy.org/tools/dna.html）把Lc-ACO1基因的cDNA序列翻譯成氨基酸序列，再通過(guò)NCBI上的BlastX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析，利用DNAMAN 5.0 和Clustal W進(jìn)行不同物種間基因的氨基酸序列比對(duì)，并結(jié)合MEGA 5 軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 Lc-ACO1熒光定量表達(dá)分析

取1 μg RNA為模板，以寡核苷酸Oligo（dT）為引物，反轉(zhuǎn)錄酶用M-MLV（Promega），反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μL，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR Green I（Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit）在ABI（Applied Biosystems）7500進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量引物在基因的非保守區(qū)內(nèi)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)好的引物通過(guò)引物軟件oligo 6.0進(jìn)行引物對(duì)的評(píng)價(jià)，最后將符合條件的引物對(duì)送到上海生工公司合成。拿到引物后首先進(jìn)行溶解曲線的制備，如果溶解曲線只出現(xiàn)單一的一個(gè)峰，說(shuō)明引物的特異性比較好，可以進(jìn)行后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。根據(jù)Zhong等[8]的研究，本文選用Lc-gapdh基因作為內(nèi)參。對(duì)反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 分別進(jìn)行6倍梯度稀釋，來(lái)進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，進(jìn)而得到Lc-ACO1基因的擴(kuò)增效率為92.2%，Lc-gapdh基因的擴(kuò)增效率為93.8%，所以可以用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行基因表達(dá)量的分析。做表達(dá)曲線時(shí)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，反應(yīng)體系為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量的檢測(cè)

提取的RNA經(jīng)DNA消化后用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定RNA樣品的OD260和OD280的值，經(jīng)計(jì)算得出各樣品RNA OD260/OD280比值均在1.9～2.0，表明總RNA的純度較高。電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果并照相由圖1可知28S、18S rRNA帶型完整， 28S與18S的比例接近2∶1，邊沿清晰銳利，表明提取的總RNA質(zhì)量高，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 Lc-ACO1基因的cDNA全長(zhǎng)分離、序列分析與同源性比較

通過(guò)RT-PCR和RACE擴(kuò)增相結(jié)合的方法，從荔枝中獲得Lc-ACO1基因的cDNA全長(zhǎng)序列。該基因cDNA序列全長(zhǎng)為1 231 bp，其中5′非編碼區(qū)包含89 bp，3′非編碼區(qū)包含215 bp，開(kāi)放閱讀框包含927 bp，編碼309個(gè)氨基酸。應(yīng)用NCBI上的BlastX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 軟件對(duì)Lc-ACO1基因進(jìn)行序列同源性搜索，結(jié)果顯示該基因與多種植物ACO 基因的氨基酸序列具有較高的同源性（表2），其中與龍眼的同源性最高的為95% 、其次與巴西橡膠的同源性為90%。應(yīng)用Clustal W 程序，將Lc-ACO1基因推導(dǎo)的氨基酸序列與NCBI 上已登錄的其他植物的ACO基因編碼的氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)結(jié)果表明，Lc-ACO1基因含有ACO基因特有的7個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)不變的氨基酸殘基。采用MEGA 5 軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），構(gòu)建荔枝與龍眼等27 種植物的ACO基因氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)（圖3），該進(jìn)化樹(shù)顯示，Lc-ACO1基因與龍眼的親緣關(guān)系最近、其次為巴西橡膠，這一結(jié)果與同源性分析結(jié)果相一致。

2.3 NAA處理對(duì)‘黑葉荔枝幼果脫落的影響

由圖4可以看出，NAA處理后的7 d內(nèi)，處理與對(duì)照的相對(duì)落果率均呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)，但兩者之間沒(méi)有差異，從第7天開(kāi)始，NAA處理的相對(duì)落果率快速上升，而對(duì)照的反而有所下降，因此在第10天時(shí)兩者差異顯著拉大，處理為對(duì)照的7.8倍。

2.4 NAA處理對(duì)Lc-ACO1基因在離區(qū)中表達(dá)的影響

由圖5可以看出，NAA處理后的7 d內(nèi)，離區(qū)Lc-ACO1基因的表達(dá)量隨時(shí)間進(jìn)程呈上升趨勢(shì)，7 d后呈下降趨勢(shì)。NAA處理與對(duì)照中Lc-ACO1表達(dá)最大的差別一是在處理后3～7 d期間，處理急速上升，對(duì)照緩慢上升，并均在第7天達(dá)到最大值，且處理為對(duì)照的1.5倍；二是在處理后7～10 d期間，處理表現(xiàn)為急速下降，對(duì)照表現(xiàn)為緩慢下降，且在第10 d時(shí)，處理中該基因的表達(dá)量稍低于對(duì)照。

2.5 NAA處理對(duì)Lc-ACO1基因在幼果中表達(dá)的影響

由圖6可以看出，對(duì)照幼果中Lc-ACO1基因的表達(dá)量在0～3 d之內(nèi)快速下降，爾后（3～10 d）則持續(xù)緩慢上升；而NAA處理幼果中Lc-ACO1基因的表達(dá)量在0～3 d之內(nèi)稍有增加，3～7 d期間快速上升至最大值，之后又迅速下降，并在第10天降到處理中的最低值；NAA處理與對(duì)照相比，其幼果中Lc-ACO1mRNA水平在0～7 d內(nèi)一直高于對(duì)照，其中第7天時(shí)比對(duì)照高約4.5倍，第10天時(shí)比對(duì)照低。

3 討 論

3.1 荔枝ACO基因的克隆

ACO基因最早從番茄中獲得[9]，在此基礎(chǔ)上陸續(xù)在很多植物中克隆到ACO基因，如：楊樹(shù)[10]、巴西橡膠[11]、歐洲水青岡木[12]、天竺葵[13]、 康乃馨[14]、甜瓜[15]，且在多種果樹(shù)作物上也克隆到ACO基因，如：番木瓜[16]、柿[17]、蘋果[18]、梨[19]、桃[20]，且在同屬于無(wú)患子科的龍眼上也已經(jīng)克隆出ACO基因[21]，但在荔枝上至今還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本文采用RT-PCR 和RACE 擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的方法從荔枝中克隆到一個(gè)長(zhǎng)度為1 231 bp的荔枝ACO全長(zhǎng)cDNA序列，該基因5′端非翻譯區(qū)有89 bp，3′端非翻譯區(qū)有215 bp，其推測(cè)氨基酸序列含有309個(gè)氨基酸。本文所克隆的Lc-ACO1基因含有ACO基因特有的7個(gè)保守區(qū)和9個(gè)不變氨基酸殘基，該基因在不同物種間的同源性很高，且與同屬于無(wú)患子科的龍眼同源性最高為95%，同時(shí)也與龍眼的親緣關(guān)系最近，基于以上幾點(diǎn)考慮我們認(rèn)為該基因?qū)儆贏CO基因家族成員，且在荔枝上至今為止還沒(méi)有ACO基因克隆的相關(guān)報(bào)道，所以，本文首次在荔枝上克隆出ACO基因。ACO基因均為多基因家族[22]，且不同種植物中家族成員的數(shù)目不同[23]。蘋果（Malus×domestica）中ACO由4個(gè)基因編碼[3]，番茄（Lycopersicon esculentum）中至少包括5個(gè)家族成員[24]，黃金梨（Pyrus pyrifolia）中至少由2個(gè)基因編碼[25]，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中至少包括6個(gè)家族成員[26]，水稻（Oryza sativa）中至少由3個(gè)基因編碼[27]，甜瓜中也分離到3個(gè)ACO基因[28]，但本研究只克隆到一個(gè)ACO基因，推測(cè)這可能是該基因的器官表達(dá)特異、時(shí)空表達(dá)差異、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平差異等原因造成的。

3.2 Lc-ACO1基因與荔枝幼果脫落的關(guān)系

乙烯在植物器官脫落過(guò)程中起著重要的作用，被認(rèn)為是植物脫落的天然調(diào)節(jié)劑，乙烯對(duì)果實(shí)脫落的促進(jìn)作用已有很多報(bào)道[29-31]。植物體內(nèi)乙烯生物合成的途徑為：MET（甲硫氨酸）→SAM（腺苷甲硫氨酸）→ACC（l-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）→乙烯，ACO基因是乙烯生物合成途徑中最后一個(gè)酶、也是最關(guān)鍵的一個(gè)限速步驟、催化ACC轉(zhuǎn)化成乙烯，控制ACO基因的表達(dá)能有效地控制乙烯的生物合成[1]，進(jìn)而調(diào)控植物器官的脫落。Zhu等[32]用NAA處理‘Delicious蘋果的幼果后，幼果的落果率增加了，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)MdACO1基因在果實(shí)和離區(qū)中的表達(dá)量都明顯增加了，乙烯釋放量也增加了。Li等[31]的研究表明隨著‘Delicious蘋果的脫落，MdACO1基因在離區(qū)中的表達(dá)量增加了，乙烯的合成量也在增加。Shimon等[33]的研究表明番茄花柄脫落的過(guò)程中離區(qū)TAACO1、TAACO5等基因的表達(dá)量明顯上調(diào)了。而本研究發(fā)現(xiàn)在用NAA處理促進(jìn)荔枝幼果脫落的過(guò)程中，相對(duì)落果率的高峰出現(xiàn)在第10天，而Lc-ACO1基因在離區(qū)和幼果中的表達(dá)量高峰都出現(xiàn)在第7天，也就是基因表達(dá)量高峰相對(duì)于相對(duì)落果率高峰有提前效應(yīng)，推測(cè)這可能是通過(guò)第7天該基因的大量表達(dá)從而導(dǎo)致乙烯含量的急劇上升，進(jìn)而導(dǎo)致第10 天相對(duì)落果率大大增加。據(jù)此認(rèn)為L(zhǎng)c-ACO1基因可能是調(diào)控荔枝幼果脫落中的一個(gè)關(guān)鍵基因。

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