葡萄病毒脫除技術(shù)研究進(jìn)展

胡國君　董雅鳳

摘 要： 葡萄是我國的一種重要果樹，在長期的無性繁殖過程中受扇葉病、卷葉病、皺木復(fù)合病和斑點(diǎn)病等多種病毒病的危害，給葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來了嚴(yán)重的影響。在生產(chǎn)上，無病毒的繁殖材料是控制病毒病的主要途徑?？偨Y(jié)了莖尖培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)處理、體細(xì)胞胚再生、電療法和超低溫脫毒等方法的脫病毒原理及在葡萄病毒脫除中的應(yīng)用效果，分析了不同方法所適合脫除的病毒種類。通過對(duì)上述研究進(jìn)展的綜述，以期為我國葡萄病毒脫除技術(shù)研究提供參考信息。

關(guān)鍵詞： 葡萄； 病毒； 脫除

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪02-0304-07

葡萄（Vitis spp.）作為一種重要果樹，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，但由于長期的無性繁殖，容易感染多種病毒病害。據(jù)報(bào)道，侵染葡萄的病毒種類有60種[1]，其中，分布最廣、危害最重的葡萄病毒病害主要有扇葉病、卷葉病、皺木復(fù)合病和斑點(diǎn)病。研究表明，至少有10種病毒與葡萄卷葉病的產(chǎn)生有關(guān)，葡萄感染卷葉病毒后一般減產(chǎn)20% 左右[1-2]。皺木復(fù)合病是葡萄的一種重要的通過嫁接傳染的病毒病害，其病原還不是很明確，已有研究表明，葡萄病毒A（Grapevine virus A， GVA）、葡萄病毒B（Grapevine virus B， GVB）和沙地葡萄莖痘病毒（Grapevine rupestris stem pitting- associated virus， GRSPaV）與該病害的產(chǎn)生有關(guān)[3-4]。該病害在葡萄指示植物上產(chǎn)生四種癥狀：Kober莖溝病，LN33莖溝病，栓皮病和沙地葡萄莖痘病[5]。據(jù)報(bào)道，葡萄感染皺木復(fù)合病后產(chǎn)量可減少14%～70%，嫁接成活率降低40%，生長量減少30%[6]。由于葡萄繁殖主要靠扦插和嫁接，使得病毒長期積累和重復(fù)感染，并表現(xiàn)為復(fù)合侵染和潛伏侵染的特征，即使是同種病毒，由于侵染的品種和發(fā)病時(shí)期不同也表現(xiàn)各異，因而給病毒的識(shí)別和診斷帶來極大的困難。此外，病毒的侵染源復(fù)雜，傳播途徑廣泛也進(jìn)一步加大了防治的困難[7]。目前控制病毒病的主要途徑就是栽培無病毒的繁殖材料，建立無病毒母本園，因此，高效的病毒脫除技術(shù)是促進(jìn)葡萄無病毒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。綜述了莖尖培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)處理、體細(xì)胞胚再生、電療法和超低溫脫毒等方法在葡萄病毒脫除中的應(yīng)用，分析這些方法對(duì)不同葡萄品種及病毒種類的脫除效果，并揭示各個(gè)方法的病毒脫除機(jī)理，以供參考。

1 莖尖培養(yǎng)脫毒

很早以前人們就發(fā)現(xiàn)病毒粒子在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，感病植株的莖尖和根尖內(nèi)不含病毒或含量很低[8-9]，研究表明在莖尖處存在一個(gè)無毒區(qū)，直徑約為0.1 mm，長約為0.25 mm，此外，愈傷組織中也存在大量的健康細(xì)胞[10]，因此莖尖和愈傷組織成為獲得無病毒植株的主要材料。目前關(guān)于莖尖組織不含病毒的原因有很多種觀點(diǎn)[11]：（1）頂端分生組織分化速度快，不含維管束，病毒很難到達(dá)；（2）莖尖生長點(diǎn)細(xì)胞代謝比較旺盛，病毒合成受到限制；（3）莖尖處存在一個(gè)“病毒失活系統(tǒng)”；（4）莖尖內(nèi)生長素濃度很高，可通過干擾核酸的代謝來抑制病毒的復(fù)制。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)莖尖無毒區(qū)的存在可能是由于病毒RNA在具有分生能力的莖尖細(xì)胞中被靶向降解，即發(fā)生了RNA沉默[12]。

早在1960s莖尖培養(yǎng)就被用于葡萄病毒的脫除[13]。莖尖無毒區(qū)范圍很小，操作較為困難，而植株的再生能力與莖尖的大小成正比，病毒的脫除率與莖尖的大小成反比，研究表明，切取的葡萄莖尖小于0.3 mm，很難獲得再生植株；而莖尖大于0.4 mm，病毒則較難脫除，所以采用莖尖培養(yǎng)的方法進(jìn)行葡萄病毒脫除時(shí)，切取的莖尖大小一般為0.2～0.5 mm[2，14-15]。Habili等[16]利用莖尖培養(yǎng)的方法從24種進(jìn)口的葡萄品種中脫除了多種病毒或類似病毒引起的病害，通過指示植物和dsRNA檢測發(fā)現(xiàn)該方法脫除葡萄卷葉病的效率可達(dá)100%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)莖痘、黃斑等其他癥狀的產(chǎn)生也表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。不同部位莖尖的病毒脫除效果是不同的，Valero等[17]研究發(fā)現(xiàn)頂芽中葡萄卷葉伴隨病毒-3（Grapevine leafroll-associated virus-3， GLRaV-3）的脫除率可達(dá)91%～100%，而前3個(gè)側(cè)芽的脫除率僅為71%～87%。此外，莖尖培養(yǎng)的脫除率還與外植體采集時(shí)間有關(guān)，夏季材料的脫除率最高。韌皮部限制性病毒不能入侵莖尖等分生組織，所以莖尖培養(yǎng)的方法對(duì)這類病毒的脫除效果較好，而對(duì)于其他種類的病毒，脫除率根據(jù)葡萄的種類和病毒的分布情況而定。Gribaudo等[18]采用莖尖培養(yǎng)的方法處理16個(gè)葡萄品種的26份樣品，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)GRSPaV的脫除率僅為28.9%。莖尖培養(yǎng)的方法還被用于葡萄類病毒和細(xì)菌病害的脫毒研究中[19-20]。

2 熱處理脫毒

通常在較高溫度下，由病毒引起的病害癥狀會(huì)減輕，甚至有些新生葉片可以快速恢復(fù)健康，這一現(xiàn)象稱為“高溫隱癥”，是人們采用熱處理進(jìn)行脫毒處理的最初依據(jù)[21]。Harrison[22]推測病毒在植株中的濃度代表復(fù)制和降解的平衡，而溫度的升高可以促進(jìn)病毒的降解活性。目前熱處理脫毒的機(jī)理還不是很明確，之前人們普遍認(rèn)為病毒的鈍化溫度是高溫能夠脫除病毒的主要原因[23-24]，也有一些研究表明高溫會(huì)對(duì)植物體內(nèi)的防御酶及鈣信號(hào)傳導(dǎo)造成一定影響[25-27]。最近，一些學(xué)者在研究溫度與癥狀表現(xiàn)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下病毒產(chǎn)生的siRNA量急劇增加，所以推測熱處理脫毒可能與RNA沉默有關(guān)[28-30]。

熱處理在葡萄病毒脫除的研究中應(yīng)用比較廣泛，而且通常為獲得良好的脫毒效果，以熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方式進(jìn)行脫毒，研究表明，將熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒率較單純莖尖培養(yǎng)提高8.5%[31-32]。Monette[33]采用變溫?zé)崽幚恚?9°C/22°C）結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法對(duì)混合感染葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus， GFLV） 和南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus， ArMV）的葡萄植株進(jìn)行脫毒處理，獲得了無扇葉病毒的再生植株，但脫毒率較低，并且所有植株均未脫除ArMV。Leonhardt等[34]在恒溫35 ℃條件下處理葡萄離體植株60 d，基本上脫除了感病植株中的GFLV、ArMV和GLRaV，97個(gè)再生植株中ELISA檢測病毒為陽性的只有4株。其他學(xué)者也通過熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法獲得過無病毒葡萄植株，但GFLV脫除率都相對(duì)較低[17，35-36]。采用熱處理的方法脫除GRSPaV也相對(duì)較為困難，Gribaudo等[18]研究表明熱處理在脫除GRSPaV時(shí)的效率不足20%。Maliogka等[37]采用變溫方法（40 °C/37 °C）處理感染GRSPaV的葡萄品種‘Mantilaria和‘Prevezaniko ，脫毒效率分別為39.62%和92.85%，說明采用熱處理的方法進(jìn)行病毒脫除時(shí)，不同品種上同一種病毒的脫毒效率存在差異。Panattoni等[38]對(duì)混合感染GLRaV-1和GLRaV-3的葡萄樣品Vitis vinifera ‘Sangiovese進(jìn)行37 °C恒溫?zé)崽幚?，結(jié)果表明2種病毒的脫除率相似，均達(dá)55%以上。Diaz-Barrita等[39]對(duì)另一個(gè)同時(shí)感染這2種病毒的葡萄品種‘Chancellor進(jìn)行脫毒處理，經(jīng)RT-PCR檢測表明恒溫?zé)崽幚恚?7.2 °C）20 d獲得的莖尖再生植株完全脫除了2種病毒。Maliogka等[37]研究表明GLRaV-Pr的熱處理脫毒效率也在90%左右。此外，Panattoni等[40]在恒溫36 °C條件下處理葡萄植株57 d，獲得了無GVA的植株，脫除率為60%。熱處理按照處理材料的類型存在2種形式，一是將盆栽的葡萄苗直接放在高溫下進(jìn)行處理，然后再切取莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)；另一種形式是先將葡萄植株進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得再生植株，然后對(duì)離體植株進(jìn)行高溫處理。Gribaudo等[18]和Krizan等[41]都分別采用2種方式來脫除GFLV，結(jié)果表明盆栽苗直接熱處理的方式脫除率略高。在實(shí)際應(yīng)用中2種方法各有優(yōu)勢，盆栽苗熱處理后可以從一個(gè)處理植株上獲得多個(gè)莖尖，從而降低了對(duì)處理植株數(shù)量的要求，而離體植株熱處理占用空間小，便于統(tǒng)一管理。熱處理不適于類病毒引起的葡萄病害，Gambino等[42]對(duì)感染葡萄黃斑類病毒-1（Grapevine yellow speckle viroid-1， GYSVd-1） 、啤酒花矮化類病毒（Hop stunt viroid， HSVd）和GFLV的34株葡萄樣品進(jìn)行恒溫（34 °C）熱處理，40～99 d后對(duì)再生植株進(jìn)行帶毒情況檢測，發(fā)現(xiàn)所有植株中仍存在2種類病毒。

3 化學(xué)處理脫毒

人們?cè)陂L期的研究中發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)試劑可以延遲或抑制病毒復(fù)制，最初這些化學(xué)物質(zhì)主要在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于動(dòng)物病毒的防治，后來逐漸建立起以這些試劑的發(fā)展為基礎(chǔ)的植物病毒脫除技術(shù)體系。目前從病毒的吸附、滲透、脫衣殼到核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)合成的各個(gè)環(huán)節(jié)都有相應(yīng)的病毒抑制劑[43]。對(duì)于植物病毒來說，化學(xué)治療的主要策略是影響酶的合成，化學(xué)處理采用的試劑概括起來有以下幾種類型：次黃嘌呤單核苷脫氫酶（Inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH）、嘌呤生物合成抑制劑（Purine biosynthesis inhibitors）、神經(jīng)核苷酶抑制劑（Neuraminidase inhibitors）和SAH水解酶（S-Adenosilhomocysteine （SAH） hydrolase）等，通常將化學(xué)處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合起來進(jìn)行病毒的脫除[44-45]。

在葡萄病毒的脫除中IMPDH類抑制劑應(yīng)用較為廣泛，常用的IMPDH類抑制劑主要有病毒醚（Ribavirin）和噻唑羧胺核苷（Tiazofurin）等，其中病毒醚在葡萄病毒的脫除中應(yīng)用最廣，其作用機(jī)理主要是抑制病毒mRNA的加帽和延伸，尤其是阻止鳥嘌呤核苷5磷酸的合成以及阻止已合成的mRNA帽子結(jié)構(gòu)的甲基化反應(yīng)，從而抑制病毒核酸的合成[46-47]。病毒醚對(duì)卷葉病毒的抑制效果不明顯，Stevenson等[48]通過采用不同濃度的病毒醚來處理葡萄樣品V. vinifera ‘Liemberger，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)病毒醚對(duì)卷葉病毒的抑制作用是暫時(shí)的，不能根本上脫除該類病毒。Gutǎ等 [49]在進(jìn)行GLRaV-1的脫除研究中發(fā)現(xiàn)，病毒醚的抑制效果與再生植株的來源有一定聯(lián)系，對(duì)從植株頂端莖尖分化出的離體植株中的病毒沒有抑制作用，而對(duì)來源于第1個(gè)側(cè)芽的離體植株中的病毒有11%的抑制效率。利用病毒醚脫除GVA也比較困難，Panattoni等[40]研究表明經(jīng)20 μg·mL-1病毒醚處理60 d的15株感染GVA的葡萄植株中，只有8株ELISA檢測為病毒陰性，對(duì)這些陰性植株再進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，將病毒醚與一種SAH水解酶（Dihydroxypropyladenine adenine， DHPA）混用得到的GVA抑制率也只有40%。與卷葉病毒一樣，病毒醚對(duì)來源于植株頂端莖尖和第1個(gè)側(cè)芽的再生植株中GVA的脫除率差異也比較明顯，從植株頂端莖尖得到的再生植株中，GVA的脫除率只有33%，而從第1個(gè)側(cè)芽獲得的植株中可完全脫除該病毒[49]。病毒醚對(duì)GFLV脫除效果較好，可達(dá)94%[50]。與病毒醚不同，另一種IMPDH類試劑噻唑羧胺核苷對(duì)卷葉病毒的抑制率較高，研究表明噻唑羧胺核苷對(duì)GLRaV-1的脫除率為72%，而GLRaV-3的脫除率可達(dá)100%[45]。嘌呤生物合成抑制劑（如6-硫鳥嘌呤等）和神經(jīng)核苷酶抑制劑（如奧司他韋等）在葡萄病毒的脫除中應(yīng)用較少，Panattoni等[44]利用6-硫鳥嘌呤等和奧司他韋進(jìn)行GLRaV-3的脫除研究，結(jié)果表明2種試劑對(duì)該病毒的抑制作用相近，分別為75.1%和87%。Guta等[51]采用50 μmol·L-1奧司他韋脫除了GLRaV-1和 GLRaV-3，脫毒率為66.66%～71.42%。除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)一些中藥（如板藍(lán)根等）對(duì)葡萄病毒也有一定的抑制作用[52]。

4 體細(xì)胞胚胎發(fā)生脫毒

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指在適宜培養(yǎng)條件下植物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官可以產(chǎn)生類似胚的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過程。1958年，Reinert[53]和Steward等[54]首次報(bào)道了離體胡蘿卜組織培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，隨后在其他很多物種中也相繼報(bào)道，現(xiàn)在體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于不同的育種計(jì)劃中。20世紀(jì)70年代，Mullins等[55]首次報(bào)道了葡萄的體細(xì)胞胚胎發(fā)生。

近年來體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法在葡萄病毒的脫除中得到應(yīng)用，已經(jīng)成功脫除了多種韌皮部限制性病毒和線蟲傳多面體病毒。Goussard等[56]通過體細(xì)胞胚發(fā)生的方法成功脫除了GLRaVs，但是在新生的分生組織中仍檢測到GFLV的存在。Borroto-Fernandez等[57]通過ELISA和IC-RT-PCR的方法對(duì)46株通過體細(xì)胞胚發(fā)生的方法獲得的葡萄再生植株進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全脫除了ArMV。對(duì)于病毒混合感染的葡萄樣品，采用體細(xì)胞胚胎發(fā)生的脫除率也很高，Gambino等[5]從混合感染GLRaV-1、GLRaV-3、GVA和GRSPaV的3個(gè)葡萄品種中都獲得了無病毒再生植株，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，一般熱處理或莖尖培養(yǎng)的方法只能從1/3的感病植株中獲得無GRSPaV的葡萄植株，而采用體細(xì)胞發(fā)生的脫除率可達(dá)100%，同時(shí)，該方法在脫除GFLV時(shí)的效率也很高[58]。在葡萄類病毒的脫除研究中，體細(xì)胞胚再生的方法也表現(xiàn)出較高的脫除效率，Gambino等[42]對(duì)感染GYSVd-1和HSVd的4個(gè)葡萄樣品進(jìn)行體細(xì)胞胚再生實(shí)驗(yàn)，最后從花藥和子房的再生植株中均檢測不到2種類病毒，并且連續(xù)3 a對(duì)移栽溫室的樣品進(jìn)行跟蹤檢測，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)類病毒的再次感染。此外，單純的體細(xì)胞胚再生的方法對(duì)于一些不受維管束限制的病毒（如GFLV）沒有獲得良好的脫除效果[56]，Goussard等[59]將體細(xì)胞再生得到的植株經(jīng)恒溫35 ℃處理60 d后成功脫除了GFLV。

5 超低溫脫毒

超低溫貯存一般以液氮為冷源，在此低溫下，活細(xì)胞內(nèi)新陳代謝和生命活動(dòng)幾乎完全停止，植物材料不會(huì)發(fā)生遺傳性狀的改變，但細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能可保存。該技術(shù)具有存儲(chǔ)時(shí)間長、可最大程度的保持儲(chǔ)存胚的基因型和表型以及占用空間小等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于溫帶和熱帶植物種胚的儲(chǔ)存[60]。Brison等[61]最早將超低溫存儲(chǔ)技術(shù)用于植物病毒的脫除研究中，并成功脫除了李屬（Prunus）砧木上的李痘病毒（Plum pox potyvirus， PPV），脫除率較傳統(tǒng)方法提高了30%。之后該方法在脫除芭蕉屬（Musa spp.）植物上的黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和香蕉環(huán)紋病毒（Banana streak virus， BSV）中得到應(yīng)用[62]。