龐榮麗 方金豹等

摘 要： 【目的】為研究水果及其制品中果膠的提取條件，【方法】以蘋果、香蕉、獼猴桃等為試材，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用乙醇沉淀、硫酸-咔唑比色法，對果膠提取條件如沉淀劑類型、沉淀劑加入方式、沉淀時間，以及堿提取方式下皂化溫度、皂化時間等進行了研究。【結(jié)果】結(jié)果表明，無水乙醇是提取果膠的適宜沉淀劑，直接加入熱的無水乙醇（75 ℃），然后85 ℃水浴沉淀效果最佳；果膠含量隨水浴時間延長而增高，但超過10 min后，隨水浴時間延長而有所降低。堿提取方式下，果膠含量受皂化時間長短影響不大，皂化時間15 min就能滿足測定要求；果膠含量受皂化溫度高低影響不大，但在加熱條件下果膠測定結(jié)果有下降的趨勢，尤其是沸騰條件下測定的結(jié)果偏低。【結(jié)論】確定果膠最佳沉淀條件為用75 ℃無水乙醇在85 ℃水浴條件下沉淀10 min，堿提取方式下最佳皂化條件為室溫下提取15 min以上。在此條件下，方法的準(zhǔn)確度和精密度高，重復(fù)性和再現(xiàn)性均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

關(guān)鍵詞： 水果及其制品； 果膠； 乙醇； 皂化； 比色法

中圖分類號：S66 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0311-06

果膠是半乳糖醛酸（G.A.）的多聚合物，已被廣泛應(yīng)用于糖果、果凍、罐頭、飲料等食品中作凝膠劑和增稠劑[1]。原果膠廣泛分布于水果、蔬菜等植物中，未成熟果實內(nèi)的原果膠是初生細(xì)胞壁和胞間層的主要組分，也是植物維持一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)，對細(xì)胞壁的機械強度和物理結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵性作用[2]。當(dāng)果實成熟后，原果膠含量呈下降趨勢，而水溶性果膠含量則呈上升趨勢，果實逐步軟化[3-4]。原果膠不溶于水，但可以在酸、堿、鹽等化學(xué)試劑及酶的作用下，加水分解轉(zhuǎn)變成水溶性果膠。果膠的提取即不溶性果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠和可溶性果膠向液相轉(zhuǎn)移的過程，其提取方法主要有鹽析法[5]，酸水解法[6]，乙醇沉淀[7]，以及酶法[8]、微波輔助提取[9]、超聲波提取[10]等。用鹽提取果膠時提取液中常含有鐵、銅等金屬離子，這些金屬離子與硫酸-咔唑產(chǎn)生顏色反應(yīng)而影響果膠的測定[11]，另外在實驗中發(fā)現(xiàn)，對淀粉含量高的樣品如香蕉[12]等在用酸提取時由于葡萄糖的產(chǎn)生而干擾顯色過程，因而方法也受到一定的限制。本文參照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品衛(wèi)生檢驗方法 理化部分 總則》[13]，采用乙醇沉淀使果膠從樣品中沉淀出來，然后加入NaOH使之皂化即脫去甲氧基生成果膠酸鈉，再用硫酸-咔唑比色法進行測定，對果膠的沉淀條件、皂化條件進行研究，為制定水果及其制品中果膠物質(zhì)的測定方法標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 考慮到主要水果包含仁果類、核果類、漿果類、柑橘類以及熱帶和亞熱帶水果等，以及樣品中果膠含量高、中、低水平，選定蘋果、山楂、桃、甜櫻桃、獼猴桃、橙子、香蕉等新鮮水果以及橙汁、草莓果醬、葡萄汁等水果制品為試驗樣品，主要采自超市，于2009—2011年進行試驗。

1.1.2 試劑 無水乙醇（分析純）；氫氧化鈉（分析純）。

1.1.3 儀器 水浴振蕩器、分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 方法原理 用無水乙醇沉淀試樣中的果膠，在堿性條件下，經(jīng)水解后生成半乳糖醛酸，然后以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用硫酸-咔唑比色法進行測定。

1.2.2 試樣制備 果醬及果汁類制品將樣品攪拌均勻即可。新鮮水果，取水果樣品的可食部分，用自來水和去離子水依次清洗后，用干凈紗布輕輕擦去其表面水分。蘋果等個體較大的樣品采用對角線分割法，取對角可食部分，將其切碎，充分混勻；葡萄等個體較小的樣品可隨機取若干個體切碎混勻。用四分法取樣或直接放入組織搗碎機中制成勻漿。少汁樣品可按一定質(zhì)量比例加入等量去離子水。將勻漿后的試樣冷凍保存。

1.2.3 果膠提取條件試驗 稱取1.0～5.0 g（精確至0.001 g）勻漿后的試樣于50 mL刻度離心管中，加入少量濾紙屑，進行果膠提取條件研究。設(shè)沉淀劑加入方式（①先加10 mL水，再加25 mL熱無水乙醇（75 ℃）；②直接加35 mL63%無水乙醇；③直接加35 mL熱63%無水乙醇（75 ℃）；④直接加35 mL熱無水乙醇（75 ℃），然后85 ℃水浴，共4個處理，3次重復(fù)）、沉淀時85℃水浴時間（5、10、20、30 min，共4個處理，3次重復(fù)）、皂化時間（15、30、60、120、180 min，共5個處理，3次重復(fù)）、皂化溫度（室溫、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、沸騰100 ℃，共7個處理，3次重復(fù)）為果膠提取條件試驗。

1.2.4 果膠提取液的測定 果膠提取液的測定采用硫酸-咔唑比色法，具體測定條件和計算方法見參照文獻[7]的方法。

1.3 方法技術(shù)參數(shù)

以香蕉、獼猴桃、桃、甜櫻桃、橙汁、葡萄汁等為試材，按照國家有關(guān)測定方法標(biāo)準(zhǔn)的要求[14-15]，對方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和再現(xiàn)性等進行了測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉淀條件的確定

2.1.1 沉淀劑的選擇 果膠的提取與測定中用到的沉淀劑主要有兩類，一是電介質(zhì)如NaCl和CaCl2，二是有機溶液如甲醇、乙醇、丙酮等。用電介質(zhì)等金屬鹽類沉淀果膠，其雜質(zhì)含量較高，會干擾或掩蓋比色測定時形成的紫紅色絡(luò)合物，而甲醇和丙酮具有一定的毒性，因此本方法采用乙醇作為果膠沉淀劑。

2.1.2 沉淀劑加入方式的確定 沉淀劑乙醇的加入方式對樣品中果膠的提取是否完全非常重要，不同加入方式（①先加10 mL水，再加25 mL熱無水乙醇（75 ℃）；②直接加35 mL 63%無水乙醇；③直接加35 mL熱63%無水乙醇（75 ℃）；④直接加35 mL熱無水乙醇（75 ℃） ，然后85 ℃水浴（4個處理，3次重復(fù)）下進行果膠測定結(jié)果的方差分析和多重比較見表1。由表1可見，蘋果、香蕉、獼猴桃和桃樣品經(jīng)不同乙醇加入方式處理后，果膠含量測定結(jié)果不同，其中處理④>處理①>處理②和處理③。蘋果、獼猴桃、桃樣品處理④測得的果膠含量與處理②和處理③的結(jié)果差異均達(dá)到極顯著水平，與處理①的結(jié)果差異達(dá)到顯著水平。香蕉樣品處理④測得的果膠含量與處理②的結(jié)果差異均達(dá)到極顯著水平，與處理③的結(jié)果差異達(dá)顯著水平，與處理①的結(jié)果差異不顯著。因而確定處理④“直接加35 mL熱無水乙醇（75 ℃），然后85 ℃水浴”為本方法的沉淀條件中沉淀劑最佳加入方式。

2.1.3 85℃水浴時間的確定 水浴時間對樣品中果膠的沉淀非常重要，在一定時間內(nèi)樣品中果膠沉淀是否完全與樣品中果膠含量和樣品本身理化特性有關(guān)，85 ℃水浴不同時間（① 5 min、② 10 min、③ 20 min、④ 30 min 4個處理，3次重復(fù)）下果膠測定結(jié)果的方差分析和多重比較見表2?？梢钥闯?，果膠含量受85 ℃水浴時間長短影響較大。如蘋果和香蕉樣品85 ℃條件下水浴10 min與水浴5 min的測定結(jié)果差異達(dá)極顯著水平，與水浴20 min和水浴30 min的測定結(jié)果差異不顯著。桃樣品85 ℃條件下水浴10 min與水浴5 min和水浴30 min的測定結(jié)果差異達(dá)極顯著水平，與水浴20 min的測定結(jié)果差異不顯著。獼猴桃樣品果膠含量受85 ℃水浴時間長短影響不大，測定結(jié)果差異均不顯著，但獼猴桃和蘋果、香蕉、桃等樣品一樣也表現(xiàn)出一致的規(guī)律，即85 ℃水浴10 min的處理測得的果膠含量最高，即在10 min內(nèi)，果膠含量隨水浴時間延長而增高，但超過10 min后，果膠含量隨水浴時間延長而有所降低。因而，確定“85 ℃水浴10 min”為本方法的沉淀條件中的85 ℃水浴時間。

2.2 堿提取方式下皂化條件的確定

2.2.1 皂化時間對果膠測定的影響 果膠從樣品中沉淀出來，加入NaOH使之皂化，皂化是否完全將會影響到果膠含量的測定結(jié)果，皂化時間（15、30、60 、120、180 min 5個處理，3次重復(fù)）試驗結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，果膠含量受皂化時間長短影響不大。香蕉和橙子2個樣品檢測結(jié)果基本一致，在皂化時間15 min和180 min之間，果膠測定結(jié)果變化不明顯，說明15 min的皂化時間已能滿足多數(shù)樣品的測定要求，為保險起見，本方法將皂化時間定為至少15 min。

2.2.2 皂化溫度對果膠測定的影響 為了確定皂化溫度對果膠測定的影響，進行了皂化溫度（室溫、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、沸騰7個處理，3次重復(fù)）試驗，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，果膠含量受皂化溫度高低影響不大。香蕉和橙子2個樣品測定結(jié)果一致，在皂化條件為室溫至沸騰之間，果膠測定結(jié)果變化不明顯，但在加熱條件下果膠測定結(jié)果有下降的趨勢，尤其是沸騰條件下測定結(jié)果偏低，說明果膠皂化過程不宜加熱，室溫條件即能滿足測試要求，本方法將適宜的皂化溫度定為室溫。

2.3 樣品測定

2.3.1 準(zhǔn)確度（添加回收試驗） 以桃和草莓果醬為試驗樣品，由農(nóng)業(yè)部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（鄭州）等5家實驗室按照標(biāo)準(zhǔn)要求對方法的準(zhǔn)確度進行了試驗，回收率試驗測定結(jié)果見表3?？梢钥闯?，試驗結(jié)果為在不同時期、不同實驗室，不同樣品添加回收率都較高，桃添加回收率范圍為86.5%～95.1%，草莓果醬添加回收率范圍為86.8%～96.3%，表明本方法準(zhǔn)確度良好，符合測定方法標(biāo)準(zhǔn)的基本要求[14]。

2.3.2 精密度 由同一操作者用相同的前處理和設(shè)備，在短時間內(nèi)對香蕉、獼猴桃、桃、甜櫻桃、橙汁、葡萄汁等不同樣品中的果膠含量進行了重復(fù)測定，結(jié)果見表4。葡萄汁樣品變異系數(shù)最高（4.38%），其余樣品變異系數(shù)均低于4.0%，說明本方法精密度高，符合測定方法標(biāo)準(zhǔn)的基本要求[14]。

2.3.3 重復(fù)性和再現(xiàn)性 采用桃、香蕉、獼猴桃、山楂、草莓果醬、橙汁等6種代表性試材，按照標(biāo)準(zhǔn)要求[15]由農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（鄭州）等5家實驗室對方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性進行試驗，比對試驗統(tǒng)計結(jié)果見表5。結(jié)果表明，方法重復(fù)性變異系數(shù)為1.19%～2.88%，再現(xiàn)性變異系數(shù)為2.30%～4.39%，都小于5.0%，符合測定方法標(biāo)準(zhǔn)的基本要求。

3 討 論

研究過程中發(fā)現(xiàn)，新鮮水果和水果制品中含有較多的糖分，而應(yīng)用硫酸咔唑反應(yīng)比色測定果膠時，試樣的提取液必須是不含糖分的溶液，糖分的存在，對硫酸—半乳糖醛酸混合液的咔唑呈色引起較大的干擾，而使測定結(jié)果偏高，這與文獻[16]中所列的注意事項相符。因此應(yīng)盡量洗滌除去糖分，可通過增加洗滌果膠沉淀的次數(shù)來達(dá)到。可用糖分的穆立虛反應(yīng)法檢驗提取液是否含有糖分，即取提取液0.5 mL注入小試管中，加入5%α-萘酚的乙醇溶液2～3滴，充分混勻，此時溶液稍有白色渾濁，然后使試管稍稍傾斜，沿管壁慢慢加入濃硫酸1 mL（注意水層與濃硫酸不可混和），將試管稍予靜置后，若在兩液層的界面不產(chǎn)生紫紅色色環(huán)，則證明提取液中不含有糖分。

另外，在試驗過程中，還將試驗結(jié)果與酸提取方式進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于果膠含量較低的樣品如橙汁、草莓醬等，用堿提取和用酸提取效果差異不明顯，而果膠含量較高的樣品（如蘋果、紅棗等），堿提取條件下測定的結(jié)果偏低，這可能是原果膠含量高的樣品用堿提取不完全的緣故，說明堿提取方式還存在一定的局限性。這就需要對果膠的提取條件進行更深入的研究，以確定不同樣品果膠提取的適宜方式（如堿提取方式和酸提取方式等），為果膠的測定方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供更科學(xué)的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

根據(jù)試驗結(jié)果，認(rèn)為水果及其制品中果膠含量的測定中果膠提取條件為：最佳沉淀條件為用熱的無水乙醇（75 ℃）作為沉淀劑，在85 ℃水浴條件下沉淀10 min；在堿性提取條件下，最佳皂化條件為常溫下皂化15 min以上。該試驗條件下方法的準(zhǔn)確度、精密度、重現(xiàn)性和再現(xiàn)性均能達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

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