韓華雯，姚 拓，王國基，趙桂琴，張玉霞，馬文文，馬文彬

（甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

微生物肥料作為2l世紀的新型肥料，近年來發(fā)展速度極快，已在農資市場上占有一定份額，某些企業(yè)的年產量已達到5萬t以上。隨著人們對微生物肥料研究的不斷加深，微生物肥料質量控制一直是最突出的問題。研究表明，微生物載體是影響菌劑質量的關鍵性因素。載體是指為微生物生存和釋放提供適當環(huán)境的材料，對微生物肥料的質量有著直接的影響作用［1］。理想的載體應具有大量有序排列的微孔、比表面積大、吸附性強等特征，同時載體必須有利于菌種的生存和功能的發(fā)揮，可重復穩(wěn)定生產，對作物和土壤無毒無害［2］。Ben等［3］認為接種劑載體應當具有較高的有機質含量、適宜的N含量、pH接近中性、良好的持水能力、無毒、廉價易得的特性，同時可確保微生物在載體正常存活。泥炭是應用最廣泛的載體，它可以保證細菌數(shù)量大于108cfu/g［4，5］，但作為一種天然礦產資源具有短期不可再生性，長期開采將造成生態(tài)環(huán)境的極大破壞，并且成本較高。因此，尋找其他的材料替代泥炭顯得十分重要。

國內外常見的替代泥炭作為微生物載體的材料有土壤、蛭石、珍珠巖、硅藻土、高嶺土、淤泥、聚丙烯酰胺凝膠、海藻酸鈉、分解鋸末、煤炭、菌糠、蔗渣、鋸屑、植物堆肥、農家肥料、火山浮石［6，7］。目前，有關載體研究較少且主要集中在單一載體的篩選上，缺乏有關復合生物菌肥載體配方的研究。試驗研究利用前期從植物根際分離的優(yōu)良PGPR菌株，以泥炭、木炭、花土、有機堆肥為材料，分析不同基質作為微生物肥料載體的可行性，通過混合基質對菌劑活菌數(shù)的影響和對燕麥的促生效果，以期篩選出優(yōu)質、廉價的微生物菌肥載體配方。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試基質 將木炭、泥炭、花土、有機肥、菌糠不同基質室溫風干、粉碎過2mm篩，按照不同的質量比配比為6種混合配方，即配方1、配方2、配方3、配方4、配方5（正在申報國內發(fā)明專利）、配方6（表1），備用。

供試菌株 菌株由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院草地生物多樣性實驗室提供的3株優(yōu)良溶磷菌（Jm170Ba－cillussp.，Jm92Pseudomonassp.，Lx191Azotobactersp.）和1株聯(lián)合固氮菌（G），具有較強的固氮、溶磷、分泌IAA的能力，同時具有生長快、競爭力強及利用碳源譜廣等特點［8，9］。采用廣譜性的LB培養(yǎng)基（牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCI 5g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0），各供試菌株均能生長良好，且菌落形態(tài)明顯。

供試材料 燕麥隴燕3號（Acena sativacv.Longyan No.3），由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液制作 將LB斜面培養(yǎng)基上生長72h的1株聯(lián)合固氮菌與3株溶磷菌分別接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，置于28℃，125r/min的搖床培養(yǎng)3～5d，測定D660nm值，確保D660nm＞0.5，并用無菌水調節(jié)D660nm值一致（使菌數(shù)量處同一水平），將各種菌懸液按1∶1∶1∶1體積比混合均勻，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同基質配比對菌株吸附效果的影響測定方法 分別稱取不同基質混合配方風干樣150g，置于滅菌鍋121℃、25min連續(xù)滅菌2次。將滅菌的載體置于無菌操作臺降至室溫，倒入聚乙烯袋補加混合菌液約80mL充分混勻，封口。置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10d，待用。分別在30、60、90、120及150d測定1次有效活菌數(shù)；采用肉眼直接觀察法和顯微鏡觀察法，檢查制作的接種劑保存一段時間后是否有霉變（如青霉、曲霉污染）、是否有異味產生、是否出現(xiàn)變色等。

1.2.3 菌肥對燕麥生長的影響測定方法 試驗在甘肅農業(yè)大學蘭州牧草試驗站進行，地理位置N 36.03°，E 103.53°，位于蘭州市西北部，地處黃土高原西端，平均海拔1 525m，年降水量200～320mm，降水主要集中在夏季。供試土壤肥力均勻，土壤類型為黃綿土，黃土層較薄，土壤有機質含量0.84%，pH 7.28，土壤含鹽量0.247%，有效氮95.05mg/kg，有效磷7.32mg/kg，有效鉀182.80mg/kg。

試驗采用隨機區(qū)組設計，共設7個處理，3次重復（表1）。條播，小區(qū)面積12m2，種子用量為12kg/667m2，行距30cm。接種劑用量為1kg/667m2?；视昧繛槊绹@用量為3kg/667m2。

表1 試驗設計Table 1 Design of experiments

播種及田間管理 將制作好的接種劑與種子混合拌種，于2011年4月12日進行播種。播深3～4cm，常規(guī)田間管理。

于次年分別測定不同菌肥處理下植株的自然高度，每樣地隨機取15株，取其平均值，干草產量的測定分別在灌漿期和成熟期進行，每區(qū)每處理隨機取1m2樣段齊地刈割。刈割后曬干稱重，并換算成每公頃的干草產量和籽粒產量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel與SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，多重比較為Duncan法。

2 結果與分析

2.1 不同基質配比對菌株吸附效果的影響

載體的吸附效果是表征菌肥載體的一項重要指標，通過稀釋平板法統(tǒng)計各基質配方對菌株的吸附效果（表2）。

混合基質配方的吸附效果試驗結果表明，儲存于室溫，經30、60、90、120、150d，其有效活菌數(shù)均在108cfu/g以上，無污染，符合《微生物肥料》NY227－94標準；存30d時，菌肥1、2之間差異不顯著（P＞0.05），但與其余菌劑之間差異顯著（P＜0.05），其中，菌肥1的有效活菌數(shù)最高，為2.0×1011cfu/g，而菌肥6的活菌數(shù)最低為3.34×109cfu/g。儲存60d時，各菌肥之間的差異均不顯著，菌肥4的有效活菌數(shù)最多。

表2 不同基質配比下菌株的吸附效果Table 2 The effects of different substrates on absorption capacity of strains cfu/g

儲存90d時，以菌肥2的活菌數(shù)最高（5.00×108cfu/g），與菌肥1和5差異不顯著，菌肥4的活菌數(shù)最低，為0.67×108cfu/g。儲存120d時，菌肥1活菌數(shù)顯著優(yōu)于其余處理，其活菌數(shù)高達232×108cfu/g，其余處理差異不顯著。儲存150d時，不同菌劑的活菌數(shù)高低為菌肥5＞菌肥4＞菌肥1＞菌肥2＞菌肥6＞菌肥3，其中，菌肥5與其余處理之間存在顯著性差異。

圖1 不同菌劑活菌數(shù)的動態(tài)變化Fig.1 The dynamic change of viable bacteria for different microbial inoculum

從圖1可以看出，不同基質配比的菌肥有效活菌數(shù)均隨貯存時間的延長整體呈現(xiàn)“下降—上升—下降”的趨勢，且90d有效活菌數(shù)均達到最低值，110d有效活菌數(shù)再次出現(xiàn)峰值。菌肥1、2、3的生長模型相似，菌肥4、5相似。但從總體趨勢分析，各菌肥的活菌數(shù)隨貯存時間延長呈現(xiàn)減少的趨勢，這是由各菌肥中營養(yǎng)物的含量，產生有效菌對其的消耗及有效菌的產生及死亡最終達到平衡而決定。

2.2 菌肥對燕麥生長的影響

2.2.1 菌肥對燕麥株高的影響 株高是植物的形態(tài)指標，植株高大，有利于形成較高植物產量，而成熟期的株高直接決定作物地上植物量。結果表明，不同的施肥處理對燕麥株高影響顯著（圖2），菌肥處理燕麥株高較ck提高1.06%～15.21%，其中，菌肥1的株高最高（119.9cm），而ck僅為104.0cm。除菌肥1外，其余各處理均與ck差異不顯著（P＞0.05），菌肥1效果最佳，菌肥4次之，菌肥2效果最差。

圖2 不同菌肥成熟期燕麥株高Fig.2 Height in maturing period of oat of different bio－fertilizers

2.2.2 菌肥對燕麥干草產量的影響 不同菌肥由于其配比方式不同導致其有效菌數(shù)量各異，進而影響接種作物的干草產量。不同菌劑的施肥效果因燕麥物候期不同而存在明顯差異。灌漿期，除菌肥3和菌肥6以外，其余各菌肥草產量均高于ck，前者草產量為2 409.85～2 735.35kg/hm2，而ck僅為2 392.26 kg/hm2，前者為后者的1.0～1.1倍。其中，菌肥1干草產量最高，菌肥3干草產量最低。ck的干草產量與菌肥1燕麥干草產量差異顯著（P＜0.05），與其余各菌肥處理差異不顯著（P＞0.05）；成熟期燕麥干草產量較ck提高4.71%～24.05%，平均增產12.6%（表3），其中，菌肥5干草產量2842.88kg/hm2，為最高，菌肥1次之，菌肥2最低。ck的干草產量與菌肥1、菌肥5差異顯著（P＜0.05），與其余各處理差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同菌肥下燕麥干草產量Table 3 Hay yield of oat of different bio－fertilizers

針對燕麥生長不同的物候期（灌漿期和成熟期），菌肥1和菌肥5的促生效果明顯。菌肥1相對ck的草產量平均增長17.36%，菌肥5平均增長14.47%。

2.2.3 菌肥對燕麥籽粒產量的影響 隨施用菌肥類型的不同，燕麥籽粒產量存在較大差異（圖3）。除菌肥2，4和6外，其余處理籽粒產量顯著高于對照，分別較ck提高1.7%～10.8%，其中，以菌肥1的籽粒產量最高，為5 277.5kg/hm2，菌肥5次之，為4 850kg/hm2，而菌肥6最低，為4 232kg/hm2。菌肥1與各處理差異均顯著（P＜0.05），菌肥3和5與ck的大田施用效果相似（P＞0.05），其余處理燕麥籽粒產量不及ck，說明菌肥1對燕麥經濟產量促產效果顯著。

圖3 不同菌肥下燕麥籽粒產量Fig.3 Oat grain yield of bio－fertilizers

3 討論與結論

研究表明，以不同混合基質作為PGPR菌劑載體，隨著貯存時間的延長，活菌數(shù)呈“下降—上升—下降”的趨勢，90d活菌數(shù)降低至最低值，其中，120d活菌數(shù)略微回升，但始終低于30d活菌數(shù)，可能由于養(yǎng)分和空間的不足導致大量菌株在90d死亡，而其又能被部分存活的菌株再次吸收利用使得活菌數(shù)出現(xiàn)二次峰值。貯存期內以配方1為載體的菌肥的活菌數(shù)最優(yōu)，而菌肥2的活菌數(shù)次之，可能由于該載體配方的pH接近中性，適宜于菌株的生長繁殖。綜上所述，除90d菌肥4活菌數(shù)過低0.67×108cfu/g，其余處理貯存0～150d活菌數(shù)符合《微生物肥料》NY227－94質量標準［11］，且未出現(xiàn)污染和霉變現(xiàn)象。因此，為了保證菌肥的肥效，建議貯存4個月使用為宜，或可嘗試在其中加入一定比例的真菌抑菌劑以延長各菌肥的貯存時間［12］。

此次研究施用PGPR菌肥對燕麥的地上部的影響與葉喜文等［13］PGPR促生菌肥在水稻上應用效果的影響一致。我國自1994年已有4 000hm2小麥使用了彭于發(fā)等［14］開發(fā)的“熒光93”。中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所應用海洋放線菌MB－97的PGPR始于1997年，研制的PGPR于2000年獲得農業(yè)部產品認證并開始商品化生產與銷售，在重茬大豆上應用已達2.0×104hm2，增產15%。孫淑榮等［15］報道，通過2年4點玉米接種PGPR復合制劑田間試驗結果，不但增產效果顯著，而且十分穩(wěn)定?？墒褂衩灼骄霎a11.01%，增產幅度為7.35%～15.26%，并可替代10%～20%的化肥?？蓽p少投入750～1 050元/hm2。韓文星等［16］在PGPR菌肥對燕麥根系性狀影響的研究中報道，PGPR菌肥均可明顯促進燕麥各生育期主根長，與空白對照CK相比，燕麥主根長、根體積和根系干重分別增加16.70%～23.52%，26.87%～35.83%和53.55%～65.30%。張堃等［17］報道，PGPR菌肥對3種禾本科牧草苗期株高均有不同程度的促進作用，但其效果還不能和化肥相比。葉喜文等［13］在PG－PR促生菌肥在水稻上應用效果研究中表明，施用PGPR菌肥能顯著的改善水稻的各種經濟性狀，使株高、穗長、有效分蘗、結實率、千粒質量都明顯的增加。

施用PGPR菌肥對燕麥的干草產量和籽粒產量有一定的影響，而其對燕麥的株高影響不大，原因在于在燕麥生長發(fā)育的早期施用化肥的效果更加凸顯。菌肥的促生效果與植物的根系狀況有著密切的關聯(lián)，而植物根系的發(fā)生、生長和生理活性等受到所施用肥料的種類、施用量、施用時期和施用方法的影響。因此，施用PGPR促生菌肥應注意肥料的生產日期，最好當年施用，否則肥效會明顯降低，同時，還應注意土壤生態(tài)環(huán)境如水分、濕度、通氣狀況、pH等要適宜于有益微生物活動，以提高其肥效。

目前PGPR菌肥只能和化肥同時使用，在保證產量的基礎上，發(fā)揮其生態(tài)效益。PGPR菌肥的應用效果仍然不容忽視，PGPR菌肥與化肥相比，具有成本低、使用安全、持續(xù)效果好、增產穩(wěn)定及對環(huán)境、食品安全危害低和經濟效益高等優(yōu)點［18］，研究證實PGPR［19］一是植物的聯(lián)合固氮作用；二是分泌植物激素，可促進植物有效地吸收水分和養(yǎng)分，同時對植物體其他生命活動進行調控［20］；三是溶解土壤中的不可利用磷，將其轉化為可溶性磷；四是分泌抗生素，增強植物抗逆性［21］。PGPR作為生物肥料用于各種氣候和土壤條件下的農作物均有巨大的潛力，既可以提高農作物的產量，亦可降低農業(yè)生產的成本，減少化肥的污染，改善生態(tài)環(huán)境。但是，由于我國微生物肥料生產中還存在著產品活菌數(shù)低、品種少、效果不穩(wěn)定、成本和價格較高等問題，還有待于進一步研究。

以不同混合基質為PGPR菌劑載體，除菌肥4外，其余處理活菌數(shù)均符合《微生物肥料》NY227－94質量標準，其中，菌肥1、2的活菌數(shù)最優(yōu)，適宜作為PGPR菌肥載體；施用不同PGPR菌肥對燕麥的株高、干草產量和籽粒產量具有明顯的促進作用，其中各處理對株高影響不顯著，而燕麥草產量的增產效果與作物所處的生育期有關，灌漿期菌肥1的促生效果良好，成熟期菌肥5的促生效果較佳。菌肥1干草產量和籽粒產量較ck分別提高20.4%和10.8%，說明以配方1具有作為PGPR菌肥的良好潛力。

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