趙華強(qiáng)　穆萍萍　魏玲玲　侯萌　孫欽峰　宋暉　楊丕山

[摘要] 目的 研究慢性牙周炎病變牙齦組織中高遷移率族蛋白1（HMGB1）的表達(dá)。方法 提取健康志愿者外周血單核細(xì)胞（PBMC），以1 μg·mL-1的細(xì)菌脂多糖（LPS）刺激細(xì)胞，24 h后用免疫熒光染色法檢測(cè)HMGB1的表達(dá)，48 h后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清液中HMGB1的表達(dá)；分別以50 ng·mL-1腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和100 ng·mL-1

HMGB1刺激PBMC，48 h后檢測(cè)細(xì)胞上清液中HMGB1和TNF-α的表達(dá)。另外收集健康者和慢性牙周炎患者的牙齦組織和齦溝液，分別檢測(cè)牙齦組織和齦溝液內(nèi)HMGB1的表達(dá)。結(jié)果 LPS刺激PBMC 24 h后，HMGB1自細(xì)胞核移出至細(xì)胞質(zhì)中；刺激48 h后，細(xì)胞上清液中HMGB1的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。TNF-α和HMGB1分別刺激

PBMC 48 h后，上清液中HMGB1和TNF-α的表達(dá)水平較對(duì)照組亦有明顯增強(qiáng)（P<0.01）。在慢性牙周炎牙齦組織上

皮釘突下方浸潤(rùn)的細(xì)胞中，HMGB1自細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外；其齦溝液內(nèi)HMGB1的表達(dá)量也明顯高于健康對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)論 HMGB1可能在牙周炎病理進(jìn)程中有重要作用。

[關(guān)鍵詞] 高遷移率族蛋白； 牙周炎； 齦溝液； 外周血單核細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] R 781.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.019

慢性牙周炎在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，牙周致病菌及其產(chǎn)物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可激活宿主的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致大量免疫活性細(xì)胞浸潤(rùn)和多種炎癥介質(zhì)釋放，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，

TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）

等。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，

HMGB1）是存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)高度保守的一類(lèi)

含量豐富的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。研究[1]發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞內(nèi)HMGB1可通過(guò)活化細(xì)胞的主動(dòng)分泌，或通過(guò)壞死、受損細(xì)胞的被動(dòng)釋放進(jìn)入細(xì)胞外，誘導(dǎo)下游其他炎癥因子的產(chǎn)生，而這又會(huì)導(dǎo)致更多的HMGB1釋放[2]。由此可見(jiàn)，HMGB1是一種重要的晚期致炎

因子，對(duì)于炎癥的進(jìn)程和預(yù)后有著重要的作用，較TNF-α、IL-1β等早期速發(fā)型炎癥因子具有更重要的臨床意義。目前，已發(fā)現(xiàn)HMGB1在胰腺炎[3]、敗

血癥[4-5]等感染性疾病中具有重要作用，但在牙周炎病變組織中的表達(dá)情況還少有研究。

本研究采集人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）建立體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯?/p>

LPS刺激下細(xì)胞HMGB1的釋放情況及HMGB1與炎癥因子TNF-α之間的相互關(guān)系；另外，收集慢性牙周炎患者的病變牙齦組織和齦溝液，采用免疫組織化學(xué)染色和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno-

sorbent assay，ELISA）研究病變組織中HMGB1的表達(dá)情況，探討其在牙周炎病程中的變化和可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

兔抗HMGB1多克隆抗體（Biomol公司，美國(guó)），

德克薩斯紅耦聯(lián)羊抗兔IgG（Molecular Probes公司，

荷蘭），HMGB1和TNF-α的ELISA試劑盒（R&D;公司，美國(guó)）；Multiskan MK3型酶聯(lián)免疫分光光度儀（Ther-

mo Labsystems公司，芬蘭），共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2型，Leica Microsystems公司，德國(guó)），BX51型熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Triton X-100，

大腸桿菌LPS（Sigma公司，美國(guó)），HMGB1（Abcam

公司，英國(guó)）。

1.2 人PBMC的提取

新鮮外周血取自1名健康志愿者（男性，24歲）。抽取外周靜脈血20 mL加入PBS溶液，吹打混勻。在50 mL Falcon離心管中加入15 mL Ficoll PaqueTM plus（Amersham Biosciences公司，瑞典），在其上加入血液和PBS的混合液，然后將離心管在20 ℃、400 g條件下離心40 min。離心后，將中間相液體取出，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入PBS再離心10 min。棄掉上清液，加入含有NH4Cl和KHCO3的eryshock溶液，置于冰上10 min以去除紅細(xì)胞，其后將細(xì)胞經(jīng)沖洗和離心后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 樣本收集

收集2009—2010年于山東大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科因慢性牙周炎行牙齦翻瓣手術(shù)的6例患者術(shù)中切除的病變牙齦組織作為試驗(yàn)組，同期收集于山東大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科行埋伏牙拔除術(shù)的4例患者所切除的健康牙齦組織標(biāo)本作為健康對(duì)照組。6例牙周炎患者男性3例，女性3例；年齡48～70歲，平均（56.0±8.5）歲；術(shù)區(qū)牙齒平均探診深度為（6.63±

2.12） mm，平均附著喪失水平為（6.89±2.17） mm；

均已行牙周基礎(chǔ)治療。4例對(duì)照組患者中，男女各2例，年齡23～32歲，平均（26±7.8）歲。所有患者均于術(shù)前告之手術(shù)及取樣情況，并征得其同意。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

提取的人PBMC加入1 μg·mL-1的LPS，以未加入LPS的PBMC作為對(duì)照。靜置24 h后，分別收集細(xì)胞滴于載玻片上，離心后以4%甲醛溶液常溫固定細(xì)胞1 h，加入0.5% Triton X-100進(jìn)行透化作用，5 min后以含有2%胎牛血清白蛋白的緩沖液阻斷非特異反應(yīng)，加入抗HMGB1抗體（1∶50）4 ℃下孵育過(guò)夜。反復(fù)沖

洗后加入德克薩斯紅耦聯(lián)的羊抗兔IgG（1∶200）常溫

孵育1 h，沖洗后封片，使用含有4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片液以顯示細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀(guān)察。切取的牙齦組織以4%甲醛溶液常溫固定1 h后以石蠟包埋。部分牙齦組織進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematine-eosin，

HE）染色；部分牙齦組織經(jīng)脫蠟和乙醇梯度脫水后，以0.1 mol·L-1 C6H10O8和0.2 mol·L-1 Na2HPO4·2H2O進(jìn)行抗原修復(fù)?？乖迯?fù)后行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。以含2%胎牛血清白蛋白的緩沖液阻斷非特異反應(yīng)，然后加入抗HMGB1抗體（1∶50）4 ℃下孵育過(guò)夜，反復(fù)沖洗后加入德克薩斯紅耦聯(lián)的羊抗兔IgG（1∶200）常溫孵育1 h，反復(fù)沖洗后封片。共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。

1.5 ELISA

人PBMC加入10 μg·mL-1的LPS，以未加入LPS的細(xì)胞作為對(duì)照。靜置48 h后，檢測(cè)上清液中HMGB1的表達(dá)。分別以50 ng·mL-1 TNF-α和100 ng·mL-1 HMGB1刺激PBMC，48 h后檢測(cè)上清液中HMGB1和TNF-α的水平。按照HMGB1和TNF-α ELISA試劑盒說(shuō)明要求進(jìn)行檢測(cè)。在試驗(yàn)組患者進(jìn)行牙周手術(shù)前，選擇術(shù)區(qū)牙周探診深度最深的2顆患牙，每顆牙選擇4個(gè)

位點(diǎn)（頰舌側(cè)近中和遠(yuǎn)中）以自制濾紙條收集患者的齦溝液。合并每顆牙同側(cè)2個(gè)位點(diǎn)的齦溝液樣本，稀釋后按照HMGB1 ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)齦溝液中HMGB1的含量。收集牙齦健康對(duì)照組患者相應(yīng)牙齒的齦溝液作為對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人PBMC在LPS刺激下HMGB1釋放情況

正常情況下，人PBMC的HMGB1位于細(xì)胞核內(nèi)，如圖1A所示：紅色染色（德克薩斯紅）的HMGB1位于藍(lán)色染色（DAPI）的細(xì)胞核內(nèi)。以1 μg·mL-1的LPS刺激PBMC 24 h后，細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表現(xiàn)為紅染的HMGB1移出細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中（圖1B中箭頭所示）。

PBMC經(jīng)1 μg·mL-1的LPS刺激48 h后，收集細(xì)胞上清液行ELISA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：未經(jīng)LPS刺激的PBMC上清液中HMGB1表達(dá)量為（97.2±8.5） ng，經(jīng)

LPS刺激后的表達(dá)量為（756.2±18.5） ng，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。該結(jié)果表明，經(jīng)LPS刺激后，PBMC上清液中的HMGB1表達(dá)量明顯升高，提示細(xì)胞質(zhì)中的HMGB1釋放至細(xì)胞外。

2.2 HMGB1與TNF-α表達(dá)的關(guān)系

以50 ng·mL-1的TNF-α刺激PBMC 48 h后，收集細(xì)胞上清液，用ELISA法檢測(cè)HMGB1表達(dá)水平，結(jié)果可見(jiàn)：TNF-α刺激后，PBMC上清液中的HMGB1表達(dá)量為（1 258.3±98.6） ng，較未受刺激時(shí)的（119.4±12.6） ng明顯增強(qiáng)（P<0.01）。以100 ng·mL-1的HMGB1刺激PBMC 48 h后，上清液中TNF-α表達(dá)量為（1 320.8±

91.6） ng，較未受刺激時(shí)的（103.9±20.5） ng明顯增強(qiáng)（P<0.01）。該結(jié)果提示：HMGB1可誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生，而TNF-α的產(chǎn)生也會(huì)導(dǎo)致HMGB1的釋放。

2.3 牙周炎患者病變牙齦組織中HMGB1的表達(dá)

牙周炎組和健康對(duì)照組牙齦組織的HE和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖2所示。與健康對(duì)照組牙齦組織（圖2左上）相比，牙周炎組牙齦組織（圖2右上）上皮釘突下方可見(jiàn)有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原組織破壞。由于牙周炎局部病變組織中浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞被視為HMGB1的重要來(lái)源，本研究著重展示了上皮釘突下方細(xì)胞HMGB1的表達(dá)情況：健康對(duì)照組牙齦組織上皮釘突下方可見(jiàn)到HMGB1主要位于細(xì)胞核中（圖2左下）；而在牙周炎組牙齦組織中，HMGB1則表現(xiàn)為自細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中或至細(xì)胞外，可見(jiàn)淡染空虛的細(xì)胞核和核周及細(xì)胞間的紅染區(qū)域（圖2右下，箭頭示）。

2.4 牙周炎患者齦溝液中HMGB1的表達(dá)

牙周炎組和健康對(duì)照組齦溝液中HMGB1的表達(dá)量分別為（39.8±1.1） ng和（32.1±3.5） ng，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），牙周炎組明顯高于健康對(duì)照組。

3 討論

HMGB1是在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的高度保守的非組蛋白染色質(zhì)蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而得名[6]。HMGB1廣泛分布于淋巴組

織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織中，在肝、腦組織中主要存在于細(xì)胞質(zhì)，而在其他多數(shù)組織中則存在于細(xì)胞核[7]。在炎癥等病理?xiàng)l件下，細(xì)胞核中

的HMGB1會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，繼而釋放至細(xì)胞外。

HMGB1的功能因其所處的位置而不同。位于細(xì)胞核內(nèi)時(shí)，主要功能是穩(wěn)定核小體構(gòu)象和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；釋放到細(xì)胞外后，則作為炎癥細(xì)胞因子在炎癥免疫反應(yīng)中具有重要作用。

HMGB1通過(guò)兩種途徑釋放到細(xì)胞外。一是被動(dòng)釋放，由于HMGB1和染色體的結(jié)合不如核蛋白牢固，細(xì)胞壞死時(shí)HMGB1和染色體解離釋放至細(xì)胞外；二是主動(dòng)釋放，在激活的細(xì)胞中，如單核巨噬細(xì)胞，HMGB1由細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)入溶酶體，通過(guò)胞吐作用分泌至細(xì)胞外。在移位的過(guò)程中，HMGB1被磷酸化。研究[8-10]表明，HMGB1的釋放是通過(guò)其

與細(xì)胞表面的糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for ad-

vanced glycation end-products，RAGE）和Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）-2、TLR-4的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在多種炎癥免疫性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[11]和

系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]]，均可見(jiàn)到HMGB1自細(xì)胞核移位的情況。細(xì)胞外的HMGB1已被證實(shí)在這些疾病的病理進(jìn)程中具有重要作用。

本研究采用免疫組織化學(xué)和ELISA技術(shù)，證實(shí)了在細(xì)菌LPS的刺激下，人PBMC中的HMGB1首先自細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)中，繼而釋放至細(xì)胞外；此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以誘導(dǎo)牙周炎重要炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生，而TNF-α的產(chǎn)生又會(huì)導(dǎo)致HMGB1的釋放。在這一炎癥增強(qiáng)放大環(huán)路中，HMGB1具有重要作用。在慢性牙周炎患者的病變牙齦組織中，同樣可以見(jiàn)到HMGB1自細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)，甚至到細(xì)胞外的情況；牙周炎病變牙齒的齦溝液內(nèi)HMGB1的含量明顯高于正常牙齒。這些結(jié)果均提示細(xì)胞外的HMGB1作為一種晚期炎癥因子，可能在牙周炎的病理進(jìn)程中起作用。

盡管多種細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞[13]、上皮細(xì)胞[14]、單核巨噬細(xì)胞[1]等，均已被發(fā)現(xiàn)可在炎癥環(huán)境中釋放

HMGB1，但單核巨噬細(xì)胞仍被認(rèn)為是細(xì)胞外HMGB1的主要來(lái)源。慢性牙周炎的主要病理特點(diǎn)是局部病變區(qū)域中大量免疫活性細(xì)胞如粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的遷移和浸潤(rùn)。這些局部浸潤(rùn)的免疫活性細(xì)胞在細(xì)菌及其LPS的作用下，可分泌大量炎癥因子，當(dāng)然這些浸潤(rùn)的細(xì)胞同樣會(huì)成為HMGB1的來(lái)源。在慢性牙周炎的牙齦組織中，可以見(jiàn)到上皮釘突下方大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，這些細(xì)胞的HMGB1已由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞外。與健康牙齦相比，慢性牙周炎患者齦溝液的HMGB1表達(dá)量也明顯升高。這些結(jié)果顯示：HMGB1是一種具有較高活動(dòng)性的蛋白質(zhì)，在炎癥環(huán)境下，可以自細(xì)胞核穿梭至細(xì)胞質(zhì)并最終釋放至齦溝液內(nèi)。

牙周炎是危害口腔健康的主要疾病之一，盡管目前對(duì)其病因和病理發(fā)生機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，多種炎癥因子在其發(fā)展進(jìn)程中的作用亦得到較廣泛的研究，然而目前尚無(wú)有效的治療手段。本研究結(jié)果顯示：人PBMC在細(xì)菌LPS的刺激下可以釋放HMGB1，且HMGB1可與TNF-α形成增強(qiáng)放大環(huán)路，加速炎癥反應(yīng)進(jìn)程。在慢性牙周炎局部組織大量浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞中，HMGB1自細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)中，甚至細(xì)胞外，并最終釋放至齦溝液內(nèi)。HMGB1可能在慢性牙周炎的病理進(jìn)程中具有重要作用，探討HMGB1的作用將為牙周炎的治療提供新的思路。

致謝：感謝德國(guó)海德堡大學(xué)曼海姆醫(yī)院Benito Yard教授的大力幫助，本研究中牙齦組織切片的免疫組織化學(xué)染色在海德堡大學(xué)曼海姆醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心完成。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）