連國(guó)云，何偉逸，陳義昆，劉志剛

1)深圳大學(xué)光電子器件與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省光電子器件與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060;2)深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳 518060

紅外光譜法測(cè)定東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量的研究

連國(guó)云1，2，何偉逸2，陳義昆2，劉志剛2

1)深圳大學(xué)光電子器件與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省光電子器件與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060;2)深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳 518060

采用近紅外光譜和中紅外光譜技術(shù)測(cè)定不同個(gè)體東亞飛蝗的蛋白質(zhì)含量.以化學(xué)分析值作參比，采用偏最小二乘回歸算法，在近紅外、中紅外及全波段光譜范圍內(nèi)分別建立東亞飛蝗光譜信息與蛋白質(zhì)含量定量模型.預(yù)測(cè)結(jié)果表明，利用紅外光譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)可食昆蟲(chóng)類蛋白質(zhì)含量的快速檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程比傳統(tǒng)化學(xué)檢測(cè)法簡(jiǎn)捷高效，且中紅外光譜區(qū)域的建模效果優(yōu)于近紅外光譜區(qū)域.該研究為快速檢測(cè)可食昆蟲(chóng)類蛋白質(zhì)含量提供了借鑒.

光譜學(xué);近紅外光譜技術(shù);中紅外光譜技術(shù);東亞飛蝗;蛋白質(zhì)含量測(cè)定;偏最小二乘回歸算法

作為可食類昆蟲(chóng)的一種，東亞飛蝗富含蛋白質(zhì)，因此，有必要建立準(zhǔn)確的方法定量檢測(cè)東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量.現(xiàn)有蛋白質(zhì)含量的測(cè)定通常采用凱氏定氮法，該方法耗時(shí)，樣本量大，實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，費(fèi)用昂貴，且操作過(guò)程往往產(chǎn)生大量有害氣體污染環(huán)境.紅外光譜 (infrared spectroscopy，IRS)分析技術(shù)是利用物質(zhì)在紅外光譜區(qū)的吸收特性來(lái)測(cè)定樣品中某種或多種化學(xué)成分含量的方法，具有分析樣品量少、分析速度快、結(jié)果穩(wěn)定性好、低成本及可同時(shí)檢測(cè)多種成分等優(yōu)點(diǎn)［1-2］，在食品分析領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注，已成為食品定量檢測(cè)的一種重要技術(shù).目前，該技術(shù)已廣泛用于牛奶［3-4］、冷鮮豬肉［5］、大麥［6］、蔬菜［7］及奶粉［8-9］蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)中，并取得了較好的結(jié)果.此外，在農(nóng)作物育種方面，紅外光譜技術(shù)在品質(zhì)育種優(yōu)選上也發(fā)揮著重要作用，如測(cè)定整粒小麥［10］和黃豆［11］的蛋白質(zhì)含量.

在已有的研究［3-11］中，大都是利用近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIRS)區(qū) (約12 500～4 000 cm-1)所包含的光譜信息進(jìn)行分析，它存在光譜信息吸收強(qiáng)度弱、譜峰寬和信噪比低等缺點(diǎn).相比 NIRS，中紅外光譜(mid-infrared spectroscopy，MIRS)區(qū)(約4 000～400 cm-1)能獲得更多的光譜信息.近年，有研究［12-13］表明，MIRS所建立的光譜模型比NIRS建立的要好.本研究利用IRS分析技術(shù)，采用偏最小二乘(partial least squares，PLS)回歸算法建立對(duì)東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量快速檢測(cè)的定量分析模型，并通過(guò)分別對(duì)NIRS、MIRS以及NIRS與MIRS綜合光譜范圍建立模型，評(píng)估不同光譜波段對(duì)東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的效果.

1 材料與方法

1.1 樣品描述

東亞飛蝗成蟲(chóng)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，雌雄成體兼有.實(shí)驗(yàn)選擇61只個(gè)體大小不同的東亞飛蝗，待其糞便排完后，用60℃的水將其燙死，然后平鋪于搪瓷盤(pán)中置于55℃恒溫箱，烘干至恒重.將烘干的蝗蟲(chóng)研磨過(guò)60目篩，樣品處理完畢后立即混合均勻，裝入磨口瓶放入干燥器中備用.

1.2 材料準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)用東亞飛蝗樣本按約3∶1分為訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集，即45只作為訓(xùn)練樣本，其余16只作為預(yù)測(cè)樣本，測(cè)量值的最大和最小樣本歸為校正集.光譜測(cè)量?jī)x器是日本JASCO FTIR-4000傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer).整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程室內(nèi)溫度保持在25℃左右.為增加透射率(transmittance)，將東亞飛蝗粉末和干燥的溴化鉀粉末混合(質(zhì)量比為2∶100)，然后通過(guò)壓片機(jī)將混合物壓制成直徑約5 mm、厚度約2 mm的圓柱體，放入光譜儀中進(jìn)行透射率測(cè)試.儀器將對(duì)每個(gè)樣品自動(dòng)進(jìn)行全區(qū)間掃描32次，掃描分辨率4 cm-1，并對(duì)測(cè)試值取平均.每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均光譜值，掃描后將采集的光譜反射強(qiáng)度值輸入計(jì)算機(jī)存儲(chǔ).采集的光譜波數(shù)范圍為350～7 800 cm-1.由于在檢測(cè)范圍邊界存在一定的噪聲，最終選取400～7 700 cm-1光譜范圍進(jìn)行分析.

1.3 東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量的化學(xué)測(cè)定

采用FOSS公司生產(chǎn)的全自動(dòng)凱氏定氮分析儀測(cè)定干燥的東亞飛蝗粉末的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，作為近紅外光譜分析的定標(biāo)值.精確稱取0.5 g樣本置入消化管，加入2片消化片(V(硫酸銅)∶V(硫酸鉀)=1∶5)和12 mL濃硫酸，稍微振蕩，使?jié)饬蛩峤駱悠?然后將消化管放入消化爐，400℃下消化1 h.消化結(jié)束后，室溫冷卻15 min后，進(jìn)行蒸餾.蒸餾完畢，用標(biāo)定好的鹽酸進(jìn)行滴定，至藍(lán)灰色為滴定終點(diǎn)，并記錄鹽酸用量，以此計(jì)算東亞飛蝗的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù).

其中，w為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù);V1為樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積 (單位:mL);V2為試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積 (單位:mL);c為硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度;m為樣品的質(zhì)量(單位:mg);F為氮換算為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換系數(shù)，乳制品為 6.38，面粉為 5.70，玉米和高粱為 6.24，花生為5.46，大豆及其制品為5.71，肉與肉制品為6.25，大麥、小米、燕麥和裸麥為5.83，因本實(shí)驗(yàn)所測(cè)東亞飛蝗蛋白質(zhì)屬于肉與肉制品類，此處F值取6.25.

1.4 東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量的光譜測(cè)定方法

采用化學(xué)方法測(cè)出用于訓(xùn)練的45個(gè)定標(biāo)樣本中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù) (稱化學(xué)值).在NIRS、MIRS及全波段范圍內(nèi)分別掃出這45個(gè)訓(xùn)練樣本的光譜后，由計(jì)算機(jī)利用PLS分別建立化學(xué)值與NIRS、MIRS及全波段范圍光譜信息之間的定標(biāo)模型，求得不同波段范圍光譜信息與化學(xué)測(cè)定結(jié)果間的相關(guān)關(guān)系.PLS是最普遍使用的定量分析方法，該方法可有效去除噪聲，解決光譜共線問(wèn)題，有效提取光譜信息［7，14-15］.在獲得定標(biāo)模型后，即可通過(guò)樣品的光譜圖計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù) (稱預(yù)測(cè)值).為了檢驗(yàn)定標(biāo)模型的可靠性，用16只東亞飛蝗預(yù)測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)檢驗(yàn) (其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)已用化學(xué)方法測(cè)定)，用PLS的擬合相關(guān)系數(shù)(R)、定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (root mean square error，RMSE)及預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (standard error of prediction，SEP)作為模型的評(píng)價(jià)指標(biāo).

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜圖譜分析

隨機(jī)選取8個(gè)樣本，分別繪制NIRS區(qū)域和MIRS區(qū)域的東亞飛蝗粉末的光譜透射率曲線圖，如圖1.從中可見(jiàn)，東亞飛蝗粉末光譜曲線在NIRS區(qū)域的整體趨勢(shì)相對(duì)一致，且吸收波谷不明顯，但在MIRS區(qū)域，不同樣本透射光譜曲線間的差異性較大，且有多處明顯的吸收波谷，這是因?yàn)椴煌瑯悠返鞍踪|(zhì)含量不同，吸收波谷大小也不同.因此，由光譜圖分析可知，相對(duì)于NIRS，利用MIRS預(yù)測(cè)東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量的效果更佳，有利于對(duì)其進(jìn)行定量分析.

2.2 紅外光譜模型的建立及分析

45個(gè)訓(xùn)練樣本的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為64.38% ～77.06%，平均值為70.55%.蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)紅外分析模型采用PLS回歸算法，預(yù)處理方法為9點(diǎn)平滑，一階導(dǎo)數(shù)和SNV+Detrend.從45個(gè)訓(xùn)練樣本中隨機(jī)確定35個(gè)樣本作為校正集，其余10個(gè)樣本為檢驗(yàn)集.為提高模型的運(yùn)算速度，采用主成分分析 (principle component analysis，PCA)法確定貢獻(xiàn)最高的8個(gè)主成分作為優(yōu)化輸入特征子集，進(jìn)行PLS建模.在NIRS模型、MIRS模型及全波段模型建立后，利用檢驗(yàn)集對(duì)這3個(gè)模型進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)集的蛋白質(zhì)含量的化學(xué)值與NIRS模型預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R=0.972 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，與MIRS模型預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R=0.983 0，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，與全波段模型預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R=0.974 5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%.利用紅外光譜測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，相關(guān)系數(shù)大于0.9即可判斷為較好的預(yù)測(cè)模型.因此，從模型的相關(guān)性值和標(biāo)準(zhǔn)偏差可以認(rèn)定，紅外光譜分析法可較準(zhǔn)確地快速檢測(cè)出東亞飛蝗中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù).

圖1 隨機(jī)選取8個(gè)東亞飛蝗樣本的近、中紅外光譜圖Fig.1 NIRS and MIRS spectra of eight random Locusta migratoria manilensis samples

2.3 NIRS和MIRS的比較

為檢驗(yàn)定標(biāo)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果，分別采用NIRS模型、MIRS模型及全波段模型對(duì)16只東亞飛蝗樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，3個(gè)模型中樣本的設(shè)置保持一致，各樣品的化學(xué)測(cè)定值與利用3個(gè)模型分別得到的預(yù)測(cè)值結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 預(yù)測(cè)樣品用不同定標(biāo)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 1 Predicting results of the test samples using different calibration models 單位:%

比較NIRS模型、MIRS模型及全波段模型對(duì)測(cè)試樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果性能，結(jié)果如表2.從中可見(jiàn)，3個(gè)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果均較好，MIRS模型對(duì)東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量預(yù)測(cè)效果最佳，其次是全波段.這樣的預(yù)測(cè)結(jié)果也可以從圖1中的原始吸收光譜曲線分析得出，在NIRS部分，不同的東亞飛蝗透射率光譜曲線之間的區(qū)別主要是相互間的平行關(guān)系，這表明不同蛋白質(zhì)含量的東亞飛蝗個(gè)體之間的區(qū)別不大.相對(duì)而言，在MIRS部分，不同東亞飛蝗個(gè)體之間的曲線差異性較大.表面上似乎更難以區(qū)分，但是利用PLS模型便能較好地從光譜信號(hào)中提取出有用的建模信息，獲得較準(zhǔn)確的東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量.因此，采用MIRS光譜透射率建模的效果要優(yōu)于NIRS.

表2 不同光譜范圍的PLS模型性能比較Table 2 Performance comparison of PLS model based on different spectra ranges

結(jié) 語(yǔ)

本研究通過(guò)NIRS、MIRS及全波段光譜技術(shù)對(duì)東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定分析.以化學(xué)分析值作參比，采用PLS模型在NIRS、MIRS及全波段光譜范圍內(nèi)分別建立東亞飛蝗光譜信息與蛋白質(zhì)含量的定量模型.預(yù)測(cè)結(jié)果表明，利用紅外光譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)可食昆蟲(chóng)類蛋白質(zhì)含量的快速檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)檢測(cè)方法，且方法簡(jiǎn)捷、操作性強(qiáng).同時(shí)，中紅外光譜區(qū)域的建模效果要優(yōu)于近紅外光譜區(qū)域.該研究為今后可食類昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)含量的快速檢測(cè)提供了新方法.

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2012-09-12;

2012-12-11

Determination of protein content inLocusta migratoria manilensisbased on infrared spectroscopy

Lian Guoyun1，2，He Weiyi2，Chen Yikun2，and Liu Zhigang2?

1)Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education，Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Guangdong Province，Shenzhen University，Shenzhen 518060，P.R.China
2)Institute of Allergy and Immunology of Shenzhen University，Shenzhen 518060，P.R.China

The protein content inLocusta migratoria manilensisindividuals was determined by using near-and mid-infrared spectrum technology.Based on the chemical values of the protein content of these locusts，the quantitative relation models between the real protein content and the spectral information were respectively established in the near-infrared，mid-infrared and full-band spectral range by using the partial least squares(PLS)regression algorithm.The predicted results show that infrared spectrum technology can be used to rapidly determine the protein content of edible insects.In addition，the mid-infrared model exhibit better effects than the near-infrared one.Furthermore，the determination process is simpler and more effective than traditional chemical methods.This study provides a new method for rapid determination of protein content of edible insects.

spectroscopy;near-infrared spectroscopy;mid-infrared spectroscopy;Locusta migratoria manilensis;determination of protein content;partial least squares(PLS)regression algorithm

O 433.4

A

10.3724/SP.J.1249.2013.02200

Foundation:National High Technology Research and Development Program of China(2006AA10Z236)

?

Professor Liu Zhigang.E-mail:lgyun2005@gmail.com

:Lian Guoyun，He Weiyi，Chen Yikun，et al.Determination of protein content inLocusta migratoria manilensisbased on infrared spectroscopy ［J］.Journal of Shenzhen University Science and Engineering，2013，30(2):200-204.(in Chinese)

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目 (2006AA10Z236)

連國(guó)云 (1977-)，男 (漢族)，江西省吉安市人，深圳大學(xué)講師、博士.E-mail:lgyun2005@gmail.com

引 文:連國(guó)云，何偉逸，陳義昆，等.紅外光譜法測(cè)定東亞飛蝗蛋白質(zhì)含量的研究［J］.深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2013，30(2):200-204.

book=204,ebook=165

【中文責(zé)編:晨 兮;英文責(zé)編:新 谷】