戴新華 暴海霞 蘇福海 方 向 黃 挺 張 偉 李紅梅 王海峰

(中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013)

0 引言

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，與生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)。如果人體缺乏任何一種必需氨基酸，就可導(dǎo)致生理功能異常，影響抗體代謝的正常進(jìn)行，最后導(dǎo)致疾病。例如：纈氨酸是組成蛋白質(zhì)的基本氨基酸，是人體8種必須氨基酸之一，它與異亮氨酸和亮氨酸一起工作，促進(jìn)正常生長，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并給身體提供能量，提高動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能，影響動(dòng)物內(nèi)分泌水平。

由于氨基酸分析在蛋白質(zhì)組學(xué)、生物化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究中起著重要作用，因此，對(duì)氨基酸分析方法的研究得到世界各國的高度重視。大多數(shù)氨基酸不含芳香環(huán)等生色團(tuán)，無法直接用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物后進(jìn)行檢測(cè)。目前，對(duì)氨基酸的分析測(cè)定方法主要為以下幾種：1)衍生化離子交換色譜法[1]，2)衍生化高效液相色譜法[2-4]，3)衍生化氣相色譜法[5]，4)衍生化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]，5)衍生化毛細(xì)管電泳法[7-9]。上述方法都屬于間接法，需要先對(duì)樣品中的氨基酸進(jìn)行衍生后才能利用紫外檢、熒光、火焰離子化等檢測(cè)器或者質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，衍生法操作繁雜，衍生試劑昂貴，而且可能漏掉無法衍生的雜質(zhì)或者在衍生化過程中生成新的雜質(zhì)而導(dǎo)致錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。因此，急需研究直接法對(duì)氨基酸進(jìn)行高準(zhǔn)確度的測(cè)量，為研制氨基酸類純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和基體中目標(biāo)氨基酸的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，為復(fù)雜基體中氨基酸定量和蛋白質(zhì)定量提供可溯源的標(biāo)準(zhǔn)，為實(shí)現(xiàn)國際互認(rèn)奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

CCQM有機(jī)工作組(OAWG)組織進(jìn)行了L-纈氨酸純度測(cè)定的國際關(guān)鍵比對(duì)活動(dòng)，其代號(hào)為CCQM-K55C。該比對(duì)由國際計(jì)量局(BIPM)組織實(shí)施，中國計(jì)量科學(xué)研究院(NIM)、美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所 (NIST)、德國國家計(jì)量研究院(PTB)、韓國標(biāo)準(zhǔn)與科學(xué)研究所(KRISS)、英國政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室(LGC)和澳大利亞計(jì)量院(NMIA)等共25家實(shí)驗(yàn)室參加。本工作應(yīng)用質(zhì)量平衡法，分別對(duì)四類雜質(zhì)進(jìn)行了定量測(cè)定，建立了準(zhǔn)確可靠的L-纈氨酸純度的測(cè)定方法，并代表我國參加了CCQM-K55C比對(duì)，取得優(yōu)異成績。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：超純水(密理博公司Millipore純水儀 制備)；纈氨酸國際比對(duì)樣品2瓶(500mg/瓶)，由BIPM提供；甲酸、三氟乙酸、乙腈和甲醇，均為HPLC 級(jí)(Merck公司)；丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸(Sigma公司)；α，β，γ-氨基丁酸(Dr.Ehrenstorfer公司)；色譜柱：Primesep 100(美國)；卡爾費(fèi)休試劑(Sigma-Aldrich公司)。

主要儀器：超高壓液相色譜-電霧式檢測(cè)器UPLC-CAD(美國Waters公司的超高壓液相色譜和美國Thermo-Fisher公司的電霧式檢測(cè)器聯(lián)用)；高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀HPLC-MSMS(美國Agilent公司的6410QQQ)；頂空-火焰離子化檢測(cè)器(美國安捷倫公司的HP6890)；卡爾費(fèi)休庫侖滴定儀(Mettler Toledo公司的 DL39)；天平Mettler Toledo UMX2(量程2.1g，精度為 10-7g，梅特勒公司)，用于所有純品的稱量；天平Sartorius(量程230g，精度0.01mg，賽多利斯)用于標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)溶液的稱量。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

待測(cè)樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液均用重量法配制，高純水為溶劑。

1.3 測(cè)量方法

根據(jù)有機(jī)純品中所有雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將純物質(zhì)中的雜質(zhì)分為如下四類：1)與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)；2)易揮發(fā)性雜質(zhì)(VOCs)；3)水分；4)不揮發(fā)性雜質(zhì)。針對(duì)這四類雜質(zhì)的特點(diǎn)，分別采用如下方法對(duì)各類雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

1)HPLC-CAD方法對(duì)與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)進(jìn)行定性分析：儀器為UPLC-CAD，通過選擇合適的色譜柱、色譜流動(dòng)相組成、流速的優(yōu)化、檢測(cè)器的選擇等，最終得到HPLC-CAD方法的檢測(cè)條件如下：CAD的參數(shù)：氣體壓力：234kPa；Corona電壓：2.38kV；Corona電流：0.99μA；離子捕集電壓：20.3V；噴霧溫度：35℃。液相色譜部分的參數(shù)：色譜柱：Primesep 100(2.1×250mm，5μm)；流動(dòng)相：A：水(0.1%三氟乙酸)，B：乙腈(0.1%三氟乙酸)，流動(dòng)相比例：A:B=80:20；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣體積：2μL；運(yùn)行時(shí)間：25min。

2)HPLC-MSMS方法對(duì)與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析：儀器為液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6410 QQQ)；通過選擇合適的色譜柱，色譜流動(dòng)相組成、流速的優(yōu)化等，最終得到HPLC-MSMS方法的檢測(cè)條件如下：質(zhì)譜參數(shù)：數(shù)據(jù)采集時(shí)間：25min；掃描模式：MRM；離子模式：正離子；毛細(xì)管碎裂電壓：60V；碰撞能量：5V；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣流速：9L/min；霧化器壓力：276kPa。液相色譜參數(shù)與上述HPLC-CAD方法中的液相色譜方法相同。

此外對(duì)水分的測(cè)定采用了卡爾費(fèi)休滴定法，同時(shí)采用熱重(TGA)方法進(jìn)行驗(yàn)證；對(duì)不揮發(fā)性雜質(zhì)的測(cè)定采用了電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)，同時(shí)采用TGA方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用單點(diǎn)校正法[10]計(jì)算與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)的含量，計(jì)算公式如下：

(1)

其中，C為比對(duì)樣品中某個(gè)雜質(zhì)的濃度，mg/g；Cstd為相應(yīng)雜質(zhì)其標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，μg/g；Cs為被測(cè)樣品的濃度，mg/g；R為被測(cè)雜質(zhì)的峰面積與該物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的比值；Ps為被測(cè)雜質(zhì)純品的純度。

L-纈氨酸純度的測(cè)量按照質(zhì)量平衡法公式(2)計(jì)算：

W1=1000-[W2+W3+W4.+W5]

(2)

式中，W1為CCQM-K55C比對(duì)樣品中纈氨酸含量，mg/g；W2為與纈氨酸結(jié)構(gòu)類似組分的含量，mg/g；W3為水分含量，mg/g；W4為揮發(fā)性雜質(zhì)VOCs的含量，mg/g；W5為不揮發(fā)性雜質(zhì)/無機(jī)類雜質(zhì)含量，mg/g。

根據(jù)ISO導(dǎo)則，及L-纈氨酸計(jì)算公式(2)，得到L-纈氨酸純度測(cè)量的不確定度公式(3)如下[11]：

(3)

式中，uw1為L-纈氨酸的不確定度；uW2為與纈氨酸結(jié)構(gòu)類似組分的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；uW3為水分的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；uW4為VOCs的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；uW5為不揮發(fā)性雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)的定值結(jié)果

纈氨酸不含紫外吸收基團(tuán)，無法直接采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。示差折光檢測(cè)器不能兼容梯度淋洗，易受外界干擾；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的線性與靈敏度問題等等，都無法滿足該次比對(duì)中對(duì)于含量極低雜質(zhì)的測(cè)量。CAD是一款新型的、檢測(cè)原理獨(dú)特的通用型檢測(cè)器，不依賴于被分析物的結(jié)構(gòu)，也不需要將被分析物電離，且靈敏度可以達(dá)到pg 級(jí)，重現(xiàn)性良好。因此在本方法研究中，選用了靈敏度相對(duì)較高的通用型檢測(cè)器- CAD進(jìn)行檢測(cè)。

按照“1.3測(cè)量方法”部分中HPLC-CAD方法的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到比對(duì)樣品中與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)是丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸和另外一個(gè)未知雜質(zhì)。為了確定在Primesep100上雜質(zhì)定性的準(zhǔn)確性，我們采用了HPLC-IT-TOF-MS進(jìn)行驗(yàn)證。在HPLC-IT-TOF-MS方法中一方面能夠得到母離子和子離子的精確分子量，預(yù)測(cè)雜質(zhì)的分子式；然后，采用該雜質(zhì)的純品進(jìn)行驗(yàn)證。檢測(cè)結(jié)果表明：該方法與上述HPLC-CAD方法中得到的雜質(zhì)相同，因此，確定此次比對(duì)樣品纈氨酸中與其結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)主要是丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸。

對(duì)于上述方法中的含量相對(duì)較低的未知雜質(zhì)，通過與17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)照實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該雜質(zhì)并不是氨基酸類物質(zhì)，因此需要單獨(dú)對(duì)其進(jìn)行定性。根據(jù)該雜質(zhì)在HPLC-IT-TOF-MS上測(cè)得的精確分子量以及預(yù)測(cè)的分子式，并結(jié)合L-纈氨酸的合成途徑，初步推測(cè)該雜質(zhì)是氨基-丁酸。而氨基丁酸具有三種不同的異構(gòu)體，為了確認(rèn)樣品中是哪一種異構(gòu)體，采用LC-IT-TOF方法對(duì)三種異構(gòu)體與CCQM-K55C比對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定該雜質(zhì)為a-氨基丁酸。

為了確認(rèn)在上述不同方法中，是否還存在與主成分共流出的雜質(zhì)組分，同時(shí)為了對(duì)確定了的雜質(zhì)成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，逐一研究建立了17種氨基酸的HPLC-MSMS直接檢測(cè)法，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸的保留時(shí)間與纈氨酸完全一致。為了確認(rèn)該次比對(duì)樣品中是否存在雜質(zhì)甲硫氨酸，分別對(duì)比對(duì)樣品和甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了檢測(cè)，證實(shí)了存在與主成分共流出的雜質(zhì)甲硫氨酸，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的纈氨酸合成途徑中可能雜質(zhì)相一致。因此共得到與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)有5種，依據(jù)在色譜圖上的保留時(shí)間順序依次為丙氨酸、a-氨基丁酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(圖1所示)。

對(duì)上述經(jīng)定性分析了的5種雜質(zhì)，按照“1.3測(cè)量方法”部分中采用HPLC-MSMS方法逐一進(jìn)行了定量測(cè)定。定值方法是先采用了外標(biāo)曲線法得到雜質(zhì)的大致含量，在此基礎(chǔ)上再采用單點(diǎn)精確匹配法進(jìn)行了多次測(cè)量，按照公式(1)計(jì)算最終得到各個(gè)雜質(zhì)的含量見表1。結(jié)果表明：HPLC-MSMS方法測(cè)量的結(jié)果與該次比對(duì)的參考值的一致性好，證明了對(duì)雜質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。

表1纈氨酸中各雜質(zhì)組分的含量及與CCQM-K55C比對(duì)結(jié)果的比較

化合物名稱HPLC-MSMS測(cè)量各雜質(zhì)含量(mg/g)CCQM-K55C中各雜質(zhì)含量的平均值(mg/g)丙氨酸258254異亮氨酸196197亮氨酸205206a-氨基丁酸035035甲硫氨酸0031005

圖1 HPLC-MSMS檢測(cè)CCQM-K55C比對(duì)樣品中雜質(zhì)的總離子流和選擇離子流圖

2.2 水分的測(cè)定

采用卡爾費(fèi)休法對(duì)水分進(jìn)行測(cè)定，每次取約50mg的比對(duì)樣品，共測(cè)定三次，采用直接進(jìn)樣方式進(jìn)行測(cè)定，得到水分測(cè)量的平均值為0.27%，RSD為7.3%。為了驗(yàn)證該測(cè)定結(jié)果，采用熱重法對(duì)水分進(jìn)行了測(cè)量，得到水分含量為0.23%，與卡爾費(fèi)休法的一致性較好。在固體樣品中水分含量如此低的情況下，方法的重復(fù)性小于10%，充分說明了該方法對(duì)水分測(cè)量的準(zhǔn)確性。

2.3 揮發(fā)性雜質(zhì)的定性和定量分析

對(duì)該類雜質(zhì)的分析，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。本文采用寬口徑的毛細(xì)管柱，大體積頂空直接進(jìn)樣與質(zhì)譜聯(lián)用的方法進(jìn)行定性分析。按照實(shí)驗(yàn)部分揮發(fā)性雜質(zhì)的測(cè)定條件，根據(jù)頂空-質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果及纈氨酸的制備和純化分離過程，得到CCQM-K55C中揮發(fā)性雜質(zhì)為甲醇。按照 “1.3測(cè)量方法”部分中對(duì)揮發(fā)性雜質(zhì)的GC-FID測(cè)定條件，采用外標(biāo)曲線法進(jìn)行定量，每次取樣量約為50mg，平行測(cè)定三次，最終得到甲醇的平均含量為0.021 mg/g，測(cè)量重復(fù)性RSD為8.5%。

2.4 不揮發(fā)性雜質(zhì)的測(cè)定

對(duì)于純品物質(zhì)的分析，其中不揮發(fā)性雜質(zhì)的測(cè)定傳統(tǒng)方法主要是采用灼燒殘?jiān)姆椒?，由于國際比對(duì)樣品量的有限性(只有2瓶樣品，每瓶為500mg)，本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)不揮發(fā)性雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，得到本次比對(duì)樣品纈氨酸中無機(jī)類雜質(zhì)的總含量為0.17mg/g。為了驗(yàn)證定量的準(zhǔn)確性，采用TGA方法對(duì)該類雜質(zhì)進(jìn)行了驗(yàn)證，得到不揮發(fā)雜質(zhì)含量為0.20mg/g，與ICPMS方法測(cè)定結(jié)果相近，驗(yàn)證了不揮發(fā)性雜質(zhì)定值的準(zhǔn)確性。

2.5 不確定度評(píng)定和比對(duì)結(jié)果

采用質(zhì)量平衡法對(duì)纈氨酸純度進(jìn)行定值，其定值不確定度是各種雜質(zhì)不確定度的加合。按照式(2)和式(3)計(jì)算得到纈氨酸的不確定度及其含量如表2所示：

表2采用質(zhì)量平衡法得到CCQM-K55C纈氨酸含量及其不確定度值

化合物含量(mg/g)標(biāo)準(zhǔn)不確定u(mg/g)擴(kuò)展因子k，95%置信度擴(kuò)展不確定度U95%(mg/g)L-纈氨酸991550532106

參加該次比對(duì)的共有25個(gè)國家和地區(qū)，我們NIM在對(duì)于每類雜質(zhì)的定值結(jié)果均取得了等效度，采用質(zhì)量平衡法測(cè)定的主成分的測(cè)定結(jié)果與該次比對(duì)的參考值相差僅僅0.035%，不確定度相對(duì)較小(見圖2)，取得了國際互認(rèn)。

圖2 CCQM-K55C L-纈氨酸純度測(cè)定的比對(duì)結(jié)果

3 結(jié)論

本工作研究建立了纈氨酸純度定值方法和各類雜質(zhì)的定性和定量分析方法。對(duì)與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)，一直是高純有機(jī)物制備、純化和定值中的難點(diǎn)和關(guān)鍵，本工作通過采用HPLC-CAD、HPLC-IT-TOF-MS和HPLC-MSMS等聯(lián)用技術(shù)對(duì)與纈氨酸結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)進(jìn)行了直接定性和定量分析，結(jié)果表明該次國際關(guān)鍵比對(duì)中我們確定的雜質(zhì)組分多，測(cè)量準(zhǔn)確。尤其是我們對(duì)含量僅僅為31μg/g且與主成分共流出的甲硫氨酸進(jìn)行了定性和定量測(cè)定，是該類純物質(zhì)定值中最為困難和值得借鑒的地方。上述對(duì)與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)的定性和定量方法與傳統(tǒng)的氨基酸衍生化檢測(cè)方法相比避免了復(fù)雜繁瑣的衍生反應(yīng)、衍生反應(yīng)不完全、衍生過程生成新的副產(chǎn)物及衍生后背景干擾嚴(yán)重等的缺點(diǎn)?？傊?，本方法不僅操作相對(duì)簡單，而且檢測(cè)結(jié)果的可靠性大大提高，填補(bǔ)了氨基酸直接測(cè)量方法的空白。該方法為結(jié)構(gòu)類似的其他20種基本氨基酸純物質(zhì)和基體的定值提供了可供借鑒的模式和方法基礎(chǔ)；同時(shí)為高水平氨基酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了關(guān)鍵的定值手段。

本工作中還研究建立了有機(jī)純物質(zhì)定值中其它三類雜質(zhì)的定性和定量方法，為今后有機(jī)純物質(zhì)的定值及其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了可供借鑒的模式和方式。

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