李英慧，李家亓，孫陸，初國(guó)銘，孫志軍

一氧化氮(NO)具有舒張血管、抗血小板黏附與聚集等功能，同時(shí)它在腎單位的不同部位發(fā)揮促進(jìn)尿鈉排泄的作用［1-6］，腎臟的一氧化氮生物效應(yīng)降低是高血壓的重要特征之一［7］。一氧化氮由三種一氧化氮合酶(NOS)催化合成，包括:神經(jīng)型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)。非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)是三種一氧化氮合酶的共同內(nèi)源性抑制劑，在體內(nèi)ADMA主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)降解。多種心血管危險(xiǎn)因素可通過(guò)降低DDAH活性影響一氧化氮合酶和一氧化氮作用，從而參與高血壓發(fā)生和發(fā)展［8-10］。因此，NOS和DDAH/ADMA系統(tǒng)是調(diào)節(jié)組織一氧化氮水平從而參與血壓調(diào)節(jié)的兩個(gè)重要方面。DDAH分為兩種亞型(DDAH1和DDAH2)，DDAH2在調(diào)節(jié)ADMA代謝中發(fā)揮更為重要的作用。

乙?；瘏⑴c調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，p300是一種重要的乙酰轉(zhuǎn)移酶。我們的研究及其他報(bào)道顯示，p300介導(dǎo)的乙?；瘏⑴c三種一氧化氮合酶基因的表達(dá)調(diào)控［11，12］，迄今為止尚少見(jiàn)有關(guān)乙?；瘜?duì) DDAH基因表達(dá)調(diào)節(jié)的報(bào)道，本研究旨在探討p300是否亦參與調(diào)節(jié)DDAH2基因的表達(dá)。我們以人胚腎HEK293細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染野生型及乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300表達(dá)載體，檢測(cè)DDAH2基因表達(dá)水平及啟動(dòng)子活性變化，從而探討人胚腎HEK293細(xì)胞中乙?；瘜?duì)DDAH2表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:實(shí)驗(yàn)時(shí)間:2010-03至2011-06選取人胚腎HEK293細(xì)胞(來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)在DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，美國(guó) GIBCO 公司)、37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。0.25%的胰酶(生理鹽水配制)消化傳代。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基，應(yīng)用 LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染野生型或乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300 表達(dá)載體(Margottin-Goguet教授惠贈(zèng)［13］)，6 h 后更換為常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞待用。

Western blot雜交:單去污裂解液方法提取細(xì)胞總蛋白，煮沸后上樣至十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉。分別以1∶1000稀釋的兔p300或β-肌動(dòng)蛋白(βactin)多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)為一抗進(jìn)行雜交過(guò)夜，洗膜后加入1∶3000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫雜交2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào)。

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR):TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)常規(guī)方法提取細(xì)胞核糖核酸(RNA)，應(yīng)用DNAase I消化殘留 DNA，使用美國(guó)Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒應(yīng)用隨機(jī)引物法合成編碼脫氧核糖核酸(cDNA)。應(yīng)用 SYBR Green(日本TaKaRa公司)染料法，以β-actin為內(nèi)參，采用相對(duì)定量方法進(jìn)行real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。DDAH2特異性引物序列為:上游5'-TCCCTTCTCCACCAACTCTG-3'，下游 5'-CAACCGCTCGGATTTCTTAG-3';β-actin特異性引物序列為:上游5'-CCCAGAGCAAGAGAGGCA-3'，下游 5'-GGGAGCCACACGCAG-3'。在優(yōu)化條件下應(yīng)用AB公司7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增三次，每次設(shè)置三復(fù)孔，取平均值作為相對(duì)表達(dá)量。

DDAH2動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析及載體構(gòu)建:應(yīng)用TRANSFAC-TESS及 Alibaba軟件分析 DDAH2啟動(dòng)子區(qū)593bp(－530～+63)序列，預(yù)測(cè)其中是否存在受乙酰化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1，將+44～+63定為下游引物，上游引物分別于－530～－510，－171～151處，以人基因組DNA為模板，不同的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收純化后，將片段克隆至pMD18-T克隆載體，酶切鑒定。使用HindIII和KpnI雙酶切所得載體及熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic(美國(guó)Promega公司)，應(yīng)用T4 DNA連接酶將酶切獲得的不同長(zhǎng)度DDAH2啟動(dòng)子序列連接于pGL3-Basic載體上，進(jìn)行測(cè)序鑒定。所得載體分別命名為pGL530w和pGL171w應(yīng)用美國(guó)Axygen公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。

熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè):24孔培養(yǎng)皿中接種 HEK293 細(xì) 胞，37℃ 培 養(yǎng) 24 h，應(yīng)用LipofectamineTM2000將pGL530w DNA或pGL171w DNA及對(duì)照pRL-TK質(zhì)粒DNA(美國(guó)Promega公司)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)染野生型或突變型p300表達(dá)載體。應(yīng)用Promega公司DUAL-GLOTM雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子活性，將pGL530w或pGL171w與pRL-TK活性比值作為啟動(dòng)子相對(duì)活性。每個(gè)樣品重復(fù)三次，取平均值。

統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用t檢驗(yàn)判斷組間差異，以確定組間差異是否具有顯著性。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

p300對(duì)DDAH2 mRNA表達(dá)水平的影響:①應(yīng)用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染野生型和突變型p300表達(dá)載體的細(xì)胞中p300蛋白表達(dá)水平顯著提高(P＜0.05)。②應(yīng)用real-time PCR方法檢測(cè)了p300對(duì)DDAH2 mRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示野生型p300可顯著提高DDAH2 mRNA表達(dá)，與對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染HAT結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300載體的細(xì)胞中DDAH2 mRNA表達(dá)，與對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖2)。

DDAH2啟動(dòng)子熒光素酶基因報(bào)告基因載體的構(gòu)建:為鑒定DDAH2啟動(dòng)子活性，首先應(yīng)用TRANSFACTESS及Alibaba軟件分析了DDAH2啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其中存在多種潛在的受乙?；{(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如核因子-κB(NF-κB)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)、特異性蛋白1(Sp1)等。

根據(jù)預(yù)測(cè)到的反應(yīng)元件的位置，我們構(gòu)建了兩個(gè)DDAH2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體，分別包含DDAH2啟動(dòng)子－530～+63及－171～+63區(qū)域，命名為pGL530w和pGL171w(二者結(jié)構(gòu)如圖3所示)，并經(jīng)測(cè)序鑒定。

p300對(duì)DDAH2啟動(dòng)子活性的作用:應(yīng)用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)，我們分析了DDAH2啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，基礎(chǔ)條件下，pGL530w和pGL171w均存在較高的活性，轉(zhuǎn)染野生型p300表達(dá)載體可顯著提高二者活性，與對(duì)照(未處理細(xì)胞)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但突變型p300對(duì)二者活性的作用與對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖4)。

圖1 Western blot結(jié)果顯示表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后p300蛋白表達(dá)情況。β-actin:β-肌動(dòng)蛋白 wt-p300:轉(zhuǎn)染野生型 p300表達(dá)載體;mut-p300:轉(zhuǎn)染突變型p300表達(dá)載體 對(duì)照:未處理細(xì)胞

圖2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)結(jié)果顯示不同條件下DDAH2 mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照(未處理細(xì)胞)比較*P＜0.05。圖示三次實(shí)驗(yàn)均值±標(biāo)準(zhǔn)差;△:以 DDAH2與β-actin mRNA表達(dá)量比值作為DDAH2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增三次，每次設(shè)置三復(fù)孔，取平均值。DDAH2:二甲基精氨酸二甲胺水解酶，余注見(jiàn)圖1

圖3 兩個(gè)DDAH2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 熒光素酶結(jié)果顯示不同條件下DDAH2啟動(dòng)子活性。與對(duì)照(未處理細(xì)胞)比較*P＜0.05。圖示三次實(shí)驗(yàn)均值±標(biāo)準(zhǔn)差。△:將pGL530w或pGL171w與pRL-TK活性比值作為相對(duì)熒光素酶活性，每個(gè)樣品重復(fù)三次，取平均值，余注見(jiàn)圖1

3 討論

蛋白質(zhì)乙?；且环N生物體內(nèi)廣泛存在的表觀遺傳學(xué)修飾。多種蛋白質(zhì)(主要包括組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子)可進(jìn)行乙?；揎棧鼈?cè)谵D(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。蛋白質(zhì)的乙?；街饕軆深?lèi)酶的調(diào)節(jié)，即組蛋白HAT和組蛋白去乙?；?HDAC)。HAT將乙酰輔酶A的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)特定賴氨酸殘基而引起蛋白質(zhì)乙酰化，HDAC與其作用相反。目前已發(fā)現(xiàn)多種高血壓相關(guān)基因受乙酰化的調(diào)節(jié)，例如WNK4(一種鈉離子重吸收的調(diào)節(jié)因子)基因是一種重要的高血壓候選基因，研究顯示刺激β(2)腎上腺素受體可導(dǎo)致腎臟中AMP依賴的組蛋白去乙酰化酶8(HDAC8)活性的抑制，而引起組蛋白乙?；?，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體與WNK4啟動(dòng)子的一個(gè)負(fù)性糖皮質(zhì)激素受體反應(yīng)元件結(jié)合，導(dǎo)致WNK4表達(dá)抑制，其可能在鹽敏感性高血壓發(fā)生中具有重要意義［14］。同時(shí)有研究顯示乙?；谏窠?jīng)系統(tǒng)對(duì)血壓的調(diào)節(jié)中亦有重要意義，例如褪黑素在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞中可引起組蛋白乙?；?，從而調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，而腦干中血管舒張調(diào)節(jié)區(qū)表達(dá)高水平的褪黑素受體［15］。因此，乙?；驯徽J(rèn)為是一種重要的潛在的高血壓治療靶點(diǎn)。

一些轉(zhuǎn)錄輔激活因子已被證實(shí)具有乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，包括 p300、PCAF、GCN5 等［16，17］。p300 是研究的最為深入的具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的輔激活因子之一，它是一種具有多個(gè)重要結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白質(zhì)，其中包括一個(gè)重要的HAT結(jié)構(gòu)域，它可以催化所有四種核心組蛋白N末端的賴氨酸殘基和許多其他非組蛋白的乙?；?，并且這種乙?；δ軐?duì)p300在一些基因中的轉(zhuǎn)錄激活功能是必需的［18］。例如與野生型p300相比，HAT功能域缺失的p300不能使iNOS基因表達(dá)上調(diào)［10］。因此，為鑒定乙?；瘜?duì)DDAH2基因表達(dá)的影響，我們分別轉(zhuǎn)染了野生型及HAT結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300表達(dá)載體，real-time PCR結(jié)果顯示野生型p300顯著上調(diào)DDAH2 mRNA表達(dá)水平，而突變型p300無(wú)此作用，提示p300對(duì)DDAH2的表達(dá)上調(diào)依賴于HAT結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明p300可能通過(guò)乙?；承┑鞍踪|(zhì)而上調(diào)DDAH2 mRNA水平。同時(shí)我們注意到突變型p300可使DDAH2 mRNA水平輕度下調(diào)，這可能是由于外源的突變型p300競(jìng)爭(zhēng)性抑制了內(nèi)源性p300與某些轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的結(jié)合及其乙酰轉(zhuǎn)移酶的功能，而影響了DDAH2的轉(zhuǎn)錄。

同時(shí)，為進(jìn)一步鑒定乙?；{(diào)節(jié)DDAH2表達(dá)的機(jī)制，我們應(yīng)用軟件分析了DDAH2啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)存在多種受乙?；{(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括 NF-κB、Sp1、C/EBP 等，提示 p300 可能通過(guò)乙?；@些轉(zhuǎn)錄因子及組蛋白，而影響啟動(dòng)子活性，從而調(diào)節(jié)DDAH2基因表達(dá)。因此我們構(gòu)建了兩個(gè)DDAH2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體，與p300表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，野生型p300可顯著上調(diào)啟動(dòng)子活性，而缺失HAT結(jié)構(gòu)域的p300作用不明顯，提示p300對(duì)DDAH2啟動(dòng)子的作用依賴于其HAT結(jié)構(gòu)域，提示它通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的乙?；{(diào)節(jié)啟動(dòng)子活性，進(jìn)一步說(shuō)明了乙?；贒DAH2基因表達(dá)調(diào)控中的作用。

綜上，我們的結(jié)果顯示腎臟細(xì)胞中p300介導(dǎo)的乙?；赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)DDAH2基因啟動(dòng)子活性，從而參與調(diào)節(jié)DDAH2基因表達(dá)。我們的結(jié)果及從前的報(bào)道證明p300—乙酰化途徑同時(shí)調(diào)節(jié)NOS及DDAH/ADMA系統(tǒng)，因此其可能在組織NO生物合成種發(fā)揮重要作用，從而參與調(diào)節(jié)血壓水平，這有可能為尋找新的高血壓發(fā)生的分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，并為其治療提供新的分子靶標(biāo)。

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