劉秉揚(yáng)，聶英斌

（1.三明學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，福建三明365004；2.福建師范大學(xué)醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350007）

時(shí)間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織

劉秉揚(yáng)1，聶英斌2

（1.三明學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，福建三明365004；2.福建師范大學(xué)醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350007）

實(shí)驗(yàn)測(cè)量了在405 nm的脈沖激光激發(fā)下，人體離體正常和癌變結(jié)腸組織在635 nm熒光發(fā)射峰的時(shí)間分辨自體熒光光譜特性。采用雙指數(shù)衰減方程對(duì)時(shí)間分辨自體熒光光譜進(jìn)行擬合，得到相應(yīng)的平均熒光壽命。結(jié)果顯示：人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27±3.31）ns，二者存在顯著差異。采用時(shí)間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織的靈敏度和特異性分別為100％和93％。初步表明時(shí)間分辨自體熒光光譜有望用于診斷早期結(jié)腸癌。

時(shí)間分辨自體熒光光譜；熒光壽命，結(jié)腸組織；組織診斷

隨著激光技術(shù)的發(fā)展，采用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷已經(jīng)成為當(dāng)前臨床診斷醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要課題，備受國(guó)內(nèi)外許多研究小組的關(guān)注［1－3］。與傳統(tǒng)的病理檢查相比，激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)具有安全、無(wú)損、快速和實(shí)時(shí)在體檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)［4］。激光誘導(dǎo)熒光發(fā)射包括穩(wěn)態(tài)光譜（頻域）特性和時(shí)間分辨（時(shí)域）特性兩個(gè)方面。穩(wěn)態(tài)熒光光譜主要測(cè)量在特定激發(fā)波長(zhǎng)條件下的熒光發(fā)射光譜，通過(guò)比較熒光發(fā)射峰位置和強(qiáng)度等方面的信息來(lái)判別正常與病變組織。但是穩(wěn)態(tài)熒光光譜受到生物組織體內(nèi)環(huán)境和光學(xué)系統(tǒng)等因素的影響，無(wú)法全面表達(dá)生物組織的內(nèi)源性熒光物質(zhì)所處的微環(huán)境的物理和化學(xué)性質(zhì)。時(shí)間分辨自體熒光光譜技術(shù)不受到上述條件的限制，可以從時(shí)間弛豫和動(dòng)力學(xué)角度對(duì)熒光物質(zhì)成分進(jìn)行全面深入的研究，達(dá)到全面表征生物組織內(nèi)源性物質(zhì)生化特性的目的［5］。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外許多研究小組主要致力于穩(wěn)態(tài)自體熒光光譜診斷早期腫瘤的研究，而利用時(shí)間分辨自體熒光光譜診斷早期結(jié)腸癌方面卻鮮見報(bào)道。結(jié)腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率僅次于胃癌和食道癌位居胃腸道腫瘤的第三位［6］。傳統(tǒng)的臨床手術(shù)活檢方法在診斷早期結(jié)腸癌中具有很大的主觀隨機(jī)性，不一定能準(zhǔn)確、全面地對(duì)病灶位置定性，且活檢所需時(shí)間長(zhǎng)、步驟多，不能實(shí)現(xiàn)在體的實(shí)時(shí)診斷［7-9］。因此，臨床上亟待尋找一種能正確指導(dǎo)或替代活檢的準(zhǔn)確、快捷的診斷方法。實(shí)驗(yàn)研究了人體離體結(jié)腸組織的時(shí)間分辨自體熒光光譜，結(jié)果表明：人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27± 3.31）ns，兩者之間存在顯著差異。采用時(shí)間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織的靈敏度和特異性分別為100％和93％。

1 材料與方法

1.1 組織樣品

實(shí)驗(yàn)樣品取自福建省立醫(yī)院普通外科腸癌切除手術(shù)，每組樣品均包含實(shí)驗(yàn)組（癌變）和對(duì)照組（正常）。每個(gè)樣品均分為兩份，其中一份送臨床病理分析，另外一份采用生理鹽水進(jìn)行清洗，離體2 h之內(nèi)完成時(shí)間分辨自體熒光光譜測(cè)量。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)采用FLS920（Edinburgh Analytical Instruments，UK）熒光光譜探測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的狹縫大小可以根據(jù)所檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié)，同組實(shí)驗(yàn)條件保持一致。選取脈沖寬度為90 ps的二極管激光器（405 nm，350 mW，Edinburgh Instruments Ltd，UK）作為激發(fā)光源。

2 結(jié)果與討論

人體離體正常和癌變結(jié)腸組織在405 nm激發(fā)下的歸一化自體熒光發(fā)射光譜如圖1所示，由圖可知，人體正常和癌變結(jié)腸組織均在520和620 nm處存在發(fā)射峰。與正常組織不同的是，癌變組織在620 nm處的峰位發(fā)生約15 nm的紅移，并且在690 nm處還存在一個(gè)特征峰。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道520 nm處的熒光發(fā)射峰是由人體內(nèi)源性熒光物質(zhì)FAD產(chǎn)生，而635 nm和690 nm的熒光則是內(nèi)源性卟啉特異性產(chǎn)生［10-11］。從穩(wěn)態(tài)熒光光譜可知，人體癌變結(jié)腸組織中的內(nèi)源性卟啉相對(duì)含量顯著高于正常組織。為了深入分析兩種內(nèi)源性熒光物質(zhì)組分的相對(duì)含量差異，文章進(jìn)一步測(cè)量了兩種組織體的時(shí)間分辨自體熒光光譜。

實(shí)驗(yàn)測(cè)量了14組人體正常組織與癌變結(jié)腸組織離體樣品在405 nm激發(fā)下，635 nm處的時(shí)間分辨自體熒光光譜。人體離體正常和癌變結(jié)腸組織的時(shí)間分辨熒光光譜如圖2所示，對(duì)所獲得的時(shí)間分辨熒光光譜數(shù)據(jù)采用擬合公式(1)進(jìn)行雙指數(shù)擬合，擬合優(yōu)度R2均接近1。式中A1和A2是指前因子，代表了每種內(nèi)源性熒光物質(zhì)對(duì)總的熒光信號(hào)的貢獻(xiàn)；τ1和τ2分別代表各單一組分的熒光物質(zhì)的熒光壽命。通過(guò)擬合實(shí)驗(yàn)所得的熒光衰減曲線，就可以計(jì)算出揭示熒光衰減本質(zhì)的平均熒光壽命。

圖1 人體正常和癌變結(jié)腸組織在405 nm波長(zhǎng)激發(fā)下的歸一化熒光發(fā)射光譜

考慮不同組織樣品的組織體差異性，進(jìn)一步計(jì)算正常和癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命，采用公式(2)計(jì)算得到的人體正常與癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命如表1所示，人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27±3.31）ns，兩者之間存在顯著差異（P＜0.001）。

圖2 人體正常和癌變結(jié)腸組織的時(shí)間分辨自體熒光光譜

表1 人體正常與癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命

結(jié)果顯示，不管是正常還是癌變結(jié)腸組織，熒光壽命較短的內(nèi)源性熒光物質(zhì)的比例都比長(zhǎng)壽命內(nèi)源性熒光物質(zhì)比例高，在正常組織和癌變組織中兩種組分的相對(duì)比例分別約為（3∶1）和（2.3∶1），說(shuō)明這兩種內(nèi)源性熒光成分在不同組織類型內(nèi)的含量存在差異。DaCosta等人［12］的研究表明內(nèi)源性卟啉的熒光壽命為（14.94±0.06）ns，這與文章測(cè)量得到人體癌變結(jié)腸組織405～635 nm處的熒光壽命為（13.27±3.31）ns吻合，說(shuō)明人體癌變結(jié)腸組織中的內(nèi)源性卟啉含量顯著高于正常組織。

實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87±0.75）ns和（13.27± 3.31）ns，其平均熒光壽命及其標(biāo)準(zhǔn)偏差如圖3所示，兩者存在顯著性差異。選取人體正常和癌變結(jié)腸組織在635 nm處自體熒光的平均壽命區(qū)分閾值τ=7.0 ns，結(jié)合臨床病理診斷結(jié)果，分析得到采用時(shí)間分辨自體熒光診斷的靈敏度和特異性分別為100％和93％。

圖3 人體正常和癌變結(jié)腸組織的平均熒光壽命及其標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

人體結(jié)腸組織自體熒光的發(fā)光機(jī)理和組織體內(nèi)源性熒光物質(zhì)密切有關(guān)，不同組織中，由于內(nèi)源性熒光物質(zhì)的相對(duì)含量以及微環(huán)境不同，生理狀態(tài)和細(xì)胞代謝的不同，導(dǎo)致其時(shí)間分辨熒光光譜存在差異。本文采用時(shí)間分辨自體熒光光譜進(jìn)行人體結(jié)腸組織診斷的可行性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：人體正常和癌變結(jié)腸組織在405～635 nm激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)條件下的自體熒光平均壽命分別為（4.87± 0.75）ns和（13.27±3.31）ns，兩者之間存在顯著差異。采用時(shí)間分辨自體熒光光譜區(qū)分人體正常和癌變結(jié)腸組織的靈敏度和特異性分別為100％和93％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明采用時(shí)間分辨自體熒光光譜有望作為診斷早期結(jié)腸癌的一種有效手段。

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Time-resolved Autofluorescence Spectroscopy for Classification of Human Normal and Abnormal Colonic Tissues

LIU Bing-yang1，NIE Ying-bin2
（1.College of Electromechanical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China; 2.Key Laboratory of Optoelectronics Science and Technology for Medicine of Ministry of Education, Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China）

Time-resolved autofluorescence spectroscopies at 635 nm under 405 nm excitation were measured for human normal and abnormal colonic tissues in vitro.The main fluorescence lifetime of the tissues were calculated by the two-component lifetime fitting of time-resolved autofluorescence spectroscopies.The results showed that the average lifetime of normal and abnormal human colonic tissues are about(4.87±0.75)ns and(13.27±3.31)ns,respectively.In this method, the sensitivity and specificity for diagnosis of human colonic carcinoma tissue are 100％and 93％.Experimental results indicated that the time-resolved autofluorescence spectroscopies can be potentially used to distinguish early human colonic carcinoma tissue.

time-resolved autofluorescence spectroscopies;fluorescence lifetime;human colonic tissues;tissue diagnosis

R318.51

A

1673-4343（2013）02-0049-04

2012-12-15

三明學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目（B201009/Q）

劉秉揚(yáng)，男，福建莆田人，講師。研究方向:生物醫(yī)學(xué)光學(xué)。