青霉素鄰苯二甲醛衍生熒光法測(cè)定方法分析

王福純

【摘要】用鄰苯二甲醛衍生熒光法測(cè)定牛奶中芐青霉素殘留，以此實(shí)驗(yàn)為例，借而對(duì)青霉素鄰苯二甲醛衍生熒光法進(jìn)行分析探討。取某品牌的牛奶，準(zhǔn)確量取1毫升，然后加5毫升的酸化乙腈震蕩處理后得到樣品溶液，在與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光檢測(cè)，分析結(jié)果得出，樣品溶液中的衍生產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，且樣品溶液的平均回收率為89.1%，與標(biāo)準(zhǔn)記錄一致。所以，鄰苯二甲醛衍生熒光法能夠滿足青霉素的檢測(cè)，并且值得在以后的實(shí)驗(yàn)研究中推廣使用。

【關(guān)鍵詞】鄰苯二甲醛衍生熒光法；衍生反應(yīng)；pH；共存物質(zhì)

【中圖分類號(hào)】0626.13 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-5158（2013）01—0351—02

由于高濃度芐青霉素殘留的牛奶會(huì)影響人的身體健康，特別是長期飲用對(duì)人們的健康問題影響十分嚴(yán)重，所以，找出一種能夠靈敏的檢測(cè)高濃度芐青霉素殘留的方法具有很大的必要性。酸性條件下，青霉素的水解產(chǎn)物之一為青霉胺，它能與鄰苯二甲醛發(fā)生衍生反應(yīng)，然后生成1-硫代2-烷基異吲哚衍生物，此兩類物質(zhì)都具有較強(qiáng)的熒光，所以就建立了熒光分光光度法對(duì)芐青霉素進(jìn)行測(cè)定。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

本次研究所用的分析儀器為FP-750型熒光分光光度計(jì)，還用到了pHS 4型酸度計(jì)以及TG-16型離心機(jī)。所用的試劑主要有：鄰苯二甲醛試劑、β-巰基乙醇、芐青霉素等試劑，還有甲酸、檸檬酸、乙酸鈉、甲醇、硼酸，H3PO4、乙腈、Na2SO3以及H2O均為分析純?cè)噭玫降乃疄槿ルx子水。

1.2 方法

1.2.1 衍生反應(yīng)

取適量的芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液放置在小燒杯中。而后加入pH為2的稀HCl 1 mL，給予1小時(shí)的沸水浴。而后加入常規(guī)過甲酸溶液100 ul，在室溫下進(jìn)行30分鐘的反應(yīng)，而后對(duì)溶劑進(jìn)行加熱蒸干處理，將殘?jiān)捎胮H10.0的硼酸緩沖液進(jìn)行溶解，而后加入40ul的OPA衍生試劑，將其定容到4mL，并且放置15min后再進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)配制空白試劑。

1.2.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確量取某品牌牛奶lmL，并加入pH值為2.0的酸化乙腈5mL，充分振蕩后，讓蛋白質(zhì)能夠沉淀完全，離心將蛋白質(zhì)去除，取上清液給予少量多次加入正已烷20 mL，振蕩后靜置，將上層正已烷相予以棄去，從而使脂溶性物質(zhì)得以除去。對(duì)下層清液進(jìn)行減壓揮干處理，對(duì)殘?jiān)盟M(jìn)行溶解處理，之后采用上述衍生反應(yīng)進(jìn)行衍生處理，從而制得樣品溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在本次研究過程中所得到的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，均采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，我們認(rèn)為數(shù)據(jù)之間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

通過統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果得出樣品溶液水解1小時(shí)，衍生反應(yīng)體系pH為10.0衍生試劑的用量為40ul、衍生反應(yīng)時(shí)間為15分鐘的條件下進(jìn)行測(cè)定，線性動(dòng)態(tài)范圍為2.0-500ug/L，檢出限約為1.3uL左右，樣品的平均加標(biāo)回收率約為89.1%左右，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。

3 討論

以芐青霉素、阿莫西林、氨芐青霉素為代表的β內(nèi)酰胺類抗生素是歷史最悠久的抗微生物藥物，并且這幾類抗生素中最重要的一類。尤其是芐青霉素，由于它的廉價(jià)且具有廣譜抗菌性得以被大量使用，但當(dāng)它的使用頻率超過標(biāo)準(zhǔn)劑量時(shí)，就不能避免的導(dǎo)致牛奶中高濃度藥物殘留。長期飲用高濃度藥物殘留的牛奶會(huì)使人體腸道內(nèi)的正常菌群受到抑制，導(dǎo)致病菌、條件致病菌大量繁殖，引起局部甚至全身性的感染。長期飲用種牛奶會(huì)使人體腸道內(nèi)的正常菌群受到抑制，使致病菌、條件致病菌大量繁殖，引起全身或局部的感染。所以，許多國家對(duì)牛奶中的β內(nèi)酰胺類藥物尤其是芐青霉素殘留進(jìn)行了嚴(yán)格的控制。我國對(duì)牛奶中芐青霉素允許的最高限量為4μg/L?，F(xiàn)在常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法、電位滴定法、高效液相色譜法及色/質(zhì)聯(lián)用測(cè)定法等，熒光分光光度法雖然效果顯著，但至今還未見此類方法測(cè)定芐青霉素殘留的報(bào)道。

芐青霉素是一種無熒光的物質(zhì)，但是在酸性條件下，芐青霉素經(jīng)加熱可水解為一種叫做青霉胺的物質(zhì)，并且在巰基乙醇催化條件下，鄰苯二甲醛與青霉胺反應(yīng)，產(chǎn)生1-硫代2-烷基異吲哚衍生物，產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光效果。一般情況下，甲酸法使青霉胺的巰基磺酸化可有效抑制其巰基對(duì)巰基乙醇反應(yīng)位點(diǎn)的競(jìng)爭，更有利于衍生反應(yīng)的發(fā)生。

3.1 芐青霉素水解時(shí)間的選擇

芐青霉素水解，在酸性條件下，芐青霉素的β內(nèi)酰胺發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致分子重排，pH為2時(shí)，形成青霉二酸，進(jìn)一步加熱水解，得到目標(biāo)產(chǎn)物青霉胺。顯然，水解時(shí)間會(huì)對(duì)青霉胺的形成造成影響，在固定pH的情況下，使固定濃度的芐青霉素溶液處于沸水浴中分別水解20、30、40、50和60min，然后加入定量的甲酸，磺酸化反應(yīng)30 min，蒸干溶劑，用pH 10.0的硼酸緩沖液溶解殘?jiān)?，再加?0μL OPA衍生試劑，定容至4 mL，反應(yīng)30 min。然后測(cè)定不同水解時(shí)間下產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)所得：水解50分鐘都得到的衍生產(chǎn)物熒光強(qiáng)度相比之下穩(wěn)定，所以，為保證水解徹底，一般水解時(shí)間定為60 min。

3.2 常規(guī)過甲酸氧化處理對(duì)衍生反應(yīng)的影響

青霉胺是一種含硫氨基酸，在與OPA衍生試劑反應(yīng)生成異吲哚衍生物時(shí)，其巰基將會(huì)和β巰基乙醇發(fā)生競(jìng)爭性反應(yīng)，使目標(biāo)衍生產(chǎn)物的生成量受到影響。如果先用常規(guī)過甲酸將二硫鍵打開，并進(jìn)一步將青霉胺中的巰基氧化成磺酸基，然后再與OPA衍生試劑反應(yīng)，則可有效解決此問題。將上述水解1 h的芐青霉素溶液分別加入100μL常規(guī)過甲酸溶液和100μL水，其余處理方法同上。從圖1結(jié)果可看出，加入常規(guī)過甲酸氧化處理的溶液與未經(jīng)此處理的溶液相比，熒光強(qiáng)度增大了5倍。

3.3 pH對(duì)衍生反應(yīng)的影響

為了解pH對(duì)衍生反應(yīng)的影響，取經(jīng)上述水解和過甲酸氧化處理并蒸干后的芐青霉素溶液殘?jiān)盗?，分別用乙酸鹽緩沖液（pH 4.0、pH 5.0）、檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.0、pH 8.0）、硼酸鹽緩沖液（pH 9.0、pH 10.0）和碳酸鹽緩沖液（pH 11.0、12.0）溶解，衍生反應(yīng)條件同上。當(dāng)pH<7.0時(shí)，熒光強(qiáng)度非常小；pH 7.0-9.0時(shí)，熒光強(qiáng)度增加很快；pH 9.0～12.0時(shí)熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。產(chǎn)生這種結(jié)果的可能原因是，胺類在水溶液中可與水中質(zhì)子作用形成其共軛酸，隨著pH升高，該反應(yīng)的平衡向左移動(dòng)，使得共軛酸的形成被有效抑制，青霉胺以胺形態(tài)存在的量逐步增多，和OPA形成的衍生產(chǎn)物也就隨之增多。但當(dāng)pH>10.0后，背景干擾也隨之增大，因此衍生反應(yīng)的pH條件選擇為10.0。

3.4 OPA衍生試劑用量與衍生反應(yīng)時(shí)間的選擇

在上述優(yōu)化的反應(yīng)條件下，分別考察了不同OPA衍生試劑加入量對(duì)產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明，OPA衍生試劑與芐青霉素的摩爾濃度比大于2：1時(shí)衍生產(chǎn)物的產(chǎn)率恒定，這摩爾比對(duì)應(yīng)于OPA衍生試劑的加入量為4μL。然而，當(dāng)OPA衍生試劑在這個(gè)加入量時(shí)，衍生反應(yīng)速度很慢，導(dǎo)致產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間遞增，約50 min才能達(dá)到穩(wěn)定值。隨著OPA衍生試劑加入量的逐步增加，反應(yīng)速度逐漸加快，熒光強(qiáng)度趨穩(wěn)需時(shí)將越來越短，但對(duì)應(yīng)的背景干擾會(huì)越來越大。綜合考慮兩者的影響，選擇OPA衍生試劑加入量為40μL。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于15 min時(shí)，熒光強(qiáng)度值幾乎不變，所以衍生反應(yīng)時(shí)間確定為15 min。此外，經(jīng)檢驗(yàn)，在室溫條件下，衍生產(chǎn)物可在3 h內(nèi)保持穩(wěn)定，能夠滿足多樣品測(cè)定的需要。

結(jié)束語

實(shí)驗(yàn)證明，鄰苯二甲醛衍生熒光法適用于青霉素的測(cè)定，而且相對(duì)而言此方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)于檢測(cè)的各項(xiàng)要求也都能予以滿足，所以，在以后的實(shí)驗(yàn)研究中，建議推廣使用。

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