組織芯片在前列腺癌研究中的可靠性分析

李江 張煒明 邱梁 邱雁

組織芯片在前列腺癌研究中的可靠性分析

李江 張煒明 邱梁 邱雁

目的探討前列腺癌組織芯片結(jié)果的可靠性。方法收集48例前列腺癌病例，構(gòu)建成直徑2.0 mm的組織芯片，進行HE染色并重新評價Gleason得分，同時應(yīng)用免疫組化、原位雜交技術(shù)分別檢測EZH2，并對照常規(guī)石蠟組織切片結(jié)果，進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果前列腺癌組織芯片Gleason評分與常規(guī)石蠟切片比較，兩者總體符合率為89.58%。前列腺癌組織芯片與常規(guī)石蠟切片比較，免疫組化結(jié)果一致率為95.65%（Kappa＝0.810）；原位雜交結(jié)果一致率為90.90%（Kappa＝0.727）。結(jié)論采用規(guī)范的組織芯片制作程序，直徑2.0 mm組織芯片上的組織樣本可以反映原組織結(jié)構(gòu)的信息，可作為一種可靠的、有代表性的高通量組織分子分析工具用于前列腺癌大樣本、回顧性的臨床病理學(xué)研究。

前列腺癌；組織芯片；免疫組化；原位雜交；EZH2

前列腺癌占歐美國家男性主要死亡原因第二位，近年來隨著人口老齡化，我國前列腺癌發(fā)病率也呈明顯上升趨勢。臨床上亟待一種敏感的技術(shù)對前列腺癌早期診斷、治療、演進趨勢及預(yù)后進行評價，增加對前列腺癌本質(zhì)的認識。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和新的檢測工具如基因芯片和蛋白芯片的廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，新的基因和蛋白分子不斷被發(fā)現(xiàn)，然而對其功能的進一步研究，還應(yīng)回到組織學(xué)水平。因而，先進的組織學(xué)研究方法——組織芯片技術(shù)就顯得尤為重要。組織芯片在腫瘤研究中具有高通量、多樣本、省時快速、簡便經(jīng)濟等優(yōu)點［1］，但由于芯片上每個位點大小有限，同時前列腺癌細胞具有較大的異質(zhì)性，因此本文通過組織芯片與常規(guī)切片HE染色、免疫組化及原位雜交的結(jié)果比較對其進行可行性分析。

1 對象與方法

1.1 供體蠟塊的選擇 選擇南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2005～2007年前列腺癌根治手術(shù)標本48例，患者年齡50～81歲，平均（67.5±7.4）歲，術(shù)前均未接受過放療或化療，標本離體后均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，所收集病例均為前列腺腺泡癌，根據(jù)前列腺癌Gleason評分系統(tǒng)，Gleason≤6分18例，Gleason評分≥7分30例。

1.2前列腺癌組織芯片的構(gòu)建 復(fù)習(xí)HE切片，在相應(yīng)的蠟塊上標記具有代表性的區(qū)域1～2個，參考文獻［2］，用組織芯片點樣儀（Beecher Instruments公司）在空白蠟塊上打孔，每個組織芯直徑2.0 mm，再在腫瘤蠟塊已做標記的區(qū)域鉆取組織芯植入空白蠟塊相對應(yīng)的孔內(nèi)，設(shè)計組織陳列點數(shù)共68個。待全部組織芯植入后，將組織芯片蠟塊置55℃烘烤2 h，使組織芯與受體蠟塊完全融合。冷卻至室溫后，凍存30 min，作4 μm連續(xù)切片，多聚賴氨酸玻片（福州邁新公司）撈片，62℃烘烤3 h，備用。

1.3 免疫組化 采用EnVision二步法，高溫高壓抗原修復(fù)，DAB顯色。試劑兔抗人多克隆抗體EZH2（克隆號6A10，濃縮型）購自美國Zymed公司，工作液濃度為1∶100，操作參考試劑盒說明書。

1.4 原位雜交 EZH2原位雜交mRNA試劑盒購自武漢博士德公司，地高辛標記的EZH2寡核苷酸探針由該公司合成，序列為：5′-CAGACTGGGAAGAAATCTGAGAAGGGACCAGTTTG-3′；5′-AAGTATGTCGGCATCGAAAGAGAAATGGAAATCCC-3′。原位雜交所使用蒸餾水、器皿均用DEPC水處理。以RNA酶預(yù)處理作為陰性對照。實驗步驟嚴格參照產(chǎn)品說明書。常規(guī)切片脫蠟梯度乙醇水化；3%H2O2滅活內(nèi)源性酶；3%胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段；后固定后，在41℃恒溫箱中進行預(yù)雜交3 h及雜交過夜處理；在37℃環(huán)境中依次滴加封閉液30 min，生物素化鼠抗地高辛60 min，SABC 20 min，生物素化過氧化物酶20min；各步驟間用PBS或SSC液漂洗，最后DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封固。

1.5 結(jié)果判斷

1.5.1 組織芯片與常規(guī)組織切片HE染色重新進行Gleason評分：采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師重新對每個組織芯進行Gleason評分并與相應(yīng)常規(guī)石蠟切片Gleason評分比較，相同記為符合，否則為不符合。

1.5.2 組織芯片與常規(guī)組織切片免疫組化及原位雜交評價標準：EZH2蛋白陽性細胞胞核中呈現(xiàn)有棕黃色細顆粒。EZH2 mRNA陽性細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)有棕黃色細顆粒。采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師對組織芯片上每個位點的免疫組化及原位雜交染色進行評價，分別記數(shù)每個位點高倍鏡下100個細胞，取其平均數(shù)。陽性細胞數(shù)≤25%為陰性，＞25%為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果一致性采用Kappa法分析。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片的質(zhì)量 制作陣列蠟塊過程中，68個組織芯排列整齊，無一例缺失，用作HE染色、免疫組織化學(xué)實驗過程中均有2片組織折疊，原位雜交實驗過程中組織缺失1片，折疊2片，最終有效病例均為48例。

2.2 組織芯片HE染色結(jié)果 HE切片鏡下每一組織芯均可見具有診斷意義的腫瘤組織結(jié)構(gòu)，所有組織中，細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈紅色，核質(zhì)比清晰，細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本清楚。

2.3 組織芯片與常規(guī)切片中Gleason評分結(jié)果比較重新評價前列腺癌組織芯片的Gleason評分結(jié)果見表1，組織芯片與常規(guī)HE切片Gleason得分進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者總體符合率達到89.58%。

表1 組織芯片與常規(guī)HE切片染色中Gleason評分關(guān)系

2.4 組織芯片與常規(guī)切片免疫組化及原位雜交結(jié)果比較 EZH2蛋白、EZH2mRNA陽性信號分別定位于細胞核和細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒或團塊（圖1，2）。組織芯片陽性結(jié)果與常規(guī)切片陽性結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白、EZH2 mRNA表達符合率分別為96.65%和90.90%。統(tǒng)計學(xué)分析Kappa系數(shù)分別為0.810、0.727，均在0.7以上，說明兩者有較高的符合率，見表2。

圖1 免疫組化結(jié)果（IHC，EnVision×200）

圖2 原位雜交結(jié)果（ISH×200）

表2 組織芯片與常規(guī)切片EZH2蛋白、EZH2 mRNA結(jié)果比較（n）

3 討論

組織芯片又稱組織微陣列（tissue microarray，TMA），是將數(shù)十個乃至數(shù)以千計不同來源的組織樣品粘貼到同一張固相載體如玻璃片或硅片上，形成組織微陣列。在同一反應(yīng)條件下進行免疫組化、原位雜交、FISH和原位PCR等以了解病變組織與相應(yīng)正常組織內(nèi)靶基因或蛋白質(zhì)的細胞來源、分布特征和表達差異等。雖然該技術(shù)已在科研中得到廣泛應(yīng)用，但組織芯片的代表性和有效性仍被人們關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示，無論在組織芯片還是常規(guī)切片中，EZH2蛋白和EZH2 mRNA的表達符合率均高于90%，Kappa系數(shù)均＞0.7。表明直徑2.0 mm的組織芯片中每個組織樣本，可以反映原始組織結(jié)構(gòu)的信息，沒有出現(xiàn)明顯的偏差，從總體上是能夠代表普通組織研究的。Manley等［3］收集了Michigan大學(xué)腫瘤研究小組1995～2001年的前列腺癌病例1300例，用TMA技術(shù)對PSA、E-cadherin、p27及ki-67免疫組化表達進行研究，同樣取得了滿意結(jié)果，進行臨床、病理及分子水平的研究顯示，組織芯片上并不是每一個組織芯都能完全代表原來的組織結(jié)構(gòu)信息，但這細小的差異并不影響總體的結(jié)果，在統(tǒng)計學(xué)上沒有意義。本實驗中，EZH2免疫組化和原位雜交在組織芯片中分別有2例和4例與常規(guī)切片結(jié)果有差異，在有差異的這幾例常規(guī)切片中，我們觀察到在同一張切片中不同區(qū)域的癌細胞免疫組化和原位雜交染色的強弱及陽性細胞所占的百分數(shù)也有差別。另外在Gleason評分有差異的這幾例中，我們觀察到芯片中丟失了原來腫瘤部分信息，尤其在Gleason評分為5分、7分、9分中不符合率均較高，這些差異主要是由于腫瘤形態(tài)以及生物學(xué)特征的異質(zhì)性造成的。即使同一個腫瘤，在不同的腫瘤細胞間生物標志的表達水平也不盡一致，特別在多組織起源的腫瘤中這個問題很難避免，此外還由于標本本身的客觀性差異和閱片者主觀判斷的不穩(wěn)定性造成的。

另外，組織芯片上標本位點的丟失也是影響檢測結(jié)果可靠性的重要因素［4］。本實驗中組織丟失和折疊，也不同程度影響了結(jié)果。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在組織芯片切片和染色過程中會導(dǎo)致大約15%～30%的芯片位點標本的丟失［4］。為此，近年來有研究者就組織芯片檢測前列腺癌中腫瘤標志物表達情況的有效性和可靠性進行了探討［4］，建議增大樣本組織或采取2點甚至多點取材，可有效減少組織芯片和常規(guī)組織標本檢測結(jié)果的差異，提高組織芯片檢測的可靠性和有效性。取材時，準確的組織定位是關(guān)鍵，其次用于芯片制作的組織樣本應(yīng)略厚于常規(guī)組織取材的樣本厚度，以3.0 mm厚為宜［1］。此外，若用水漂浮裱片，水溫過高易導(dǎo)致組織片移位。若使用石蠟切片輔助帶移系統(tǒng)進行干裱片及紫外線燈烤片，同時再用0.1%E的多聚賴氨酸等預(yù)處理載玻片，能有效地避免制片過程中組織片的移位或脫落。組織芯片是否具有代表性以及實驗結(jié)果的可靠性，組織芯片樣本量及組織芯的面積的選擇也很關(guān)鍵，尤其腫瘤分化程度的差異大或腫瘤的異質(zhì)性明顯時更為重要。研究認為，在直徑為2.0 mm的組織片上有約100 000個細胞，而直徑0.6 mm的組織片上僅有約30 000個細胞。在TMA設(shè)計中不是組織片的數(shù)量越多越好，目前，國際上常用的TMA的樣本量多為60～100個，組織片的直徑在2.0 mm左右［1］。

綜上所述，本實驗無論在HE染色還是免疫組化和原位雜交結(jié)果，通過對前列腺癌組織芯片和常規(guī)切片比較表明，直徑為2.0 mm的組織芯可以代表原組織用于前列腺癌的實驗研究。該技術(shù)為前列腺癌臨床病理學(xué)研究提供了一種可靠的、快速、經(jīng)濟的高通量分析工具。

［1］ 燕曉雯，陳琴，石群立.組織芯片技術(shù)在病理學(xué)中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2003，16（4）：297-303.

［2］ 李江，范欽和，樊祥山，等.前列腺癌中EZH2 mRNA及蛋白表達與細胞增殖的關(guān)系［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2009，25（6）：615-618.

［3］ Manley S，Mucci NR，De Marzo AM，et al.Relational database structure to manage high-throughput tissue microarray data and images for pathology studies focusing on clinical outcome：the prostate specialized program of research excellencemode［J］.AM JPathol，2001，159（3）：837-843.

［4］ Mucci NR，Akdas G，Manely S，et al.Neuroendocrine expression in metastatic prostate cancer：evaluation of high throughput tissuemicroarrays to detect heterogeneous protein expression［J］.Hum Pathol，2000，31（4）：406-414.

Analysis of the reliability of tissuem icroarray in the research of prostate cancer

LI Jiang，QIU Liang，QIU Yan．Department of Pathology，Jiangsu Provincial Geriatrics Hospital，Nanjing 210024，China；ZHANGWei-ming．Departmentof Pathology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo study the reliability of tissue chip in the research of human prostate cancer.MethodsTissuemicroarray（TMA）with 2.0 mm in diameter tissue core was constructed from forty-eight cases of human prostate cancer.Gleason score was reevaluated by HE staining.EZH2 was detected by immunohistochemical（IHC）technique，and in situ hybridization（ISH）technique.At the same time the stains on the tissuemicroarrays were compared with that from the routine paraffin section.ResultsComparing the Gleason scores of prostate cancer tissue chip with that of routine paraffin section，the overall coincidence rate was 89.58%.Immunohistochemical results showed that the consistent rate of TMA and routine paraffin section was 95.65%（Kappa＝0.810）.The result in situ hybridization suggested that the consistent rate of TMA and routine paraffin section was 90.90%（Kappa＝0.727）.ConclusionsTissuemicroarrays with 2.0 mm in diameter tissue core can represent full tissue section，if the tissuemicroarrays are constructed as standard method.As a reliable and high-throughout tool it could be set on large sample and retrospective clinipathological research in the application of human prostate cancer.

prostate cancer；tissuemicroarray；imunohistochemistry；in situ hybridization；EZH2

R 737.25

A

10.3969／j.issn.1003-9198.2013.01.015

2012-02-23）

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫(yī)院病理科（李江，邱梁，邱雁）；210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科（張煒明）