益氣活血法抗乳腺癌EMT6細(xì)胞增殖的荷瘤小鼠體內(nèi)篩方研究

王 輝杜欣穎，3花寶金孫桂芝

（1中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京，100053；2中國中醫(yī)科學(xué)院腫瘤研究所，北京，100053；3中國兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院，北京，100089）

實(shí)驗(yàn)研究

益氣活血法抗乳腺癌EMT6細(xì)胞增殖的荷瘤小鼠體內(nèi)篩方研究

王 輝1，2杜欣穎1，2，3花寶金1，2孫桂芝1，2

（1中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京，100053；2中國中醫(yī)科學(xué)院腫瘤研究所，北京，100053；3中國兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院，北京，100089）

目的：篩選抗乳腺癌增殖的益氣藥、活血藥適宜配伍。探討益氣藥、活血藥抗腫瘤的配伍的內(nèi)在含義。方法：建立小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞BALB／C小鼠荷瘤模型。按照處理方式設(shè)立：空白對照組（Control）；紫杉醇組（Taxel）；黃芪+蘇木組（HQ+ SM）；黃芪+蘇木+蒲黃組（HQ+SM+PH）；黃芪+蘇木+蜂房組（HQ+SM+FF）；黃芪+蘇木+炮山甲組（HQ+SM+PSJ）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房組（HQ+SM+PH+FF）；黃芪+蘇木+蒲黃+炮山甲組（HQ+SM+PH+PSJ）；黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組（HQ+SM+FF+PSJ）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房+炮山甲組（HQ+SM+PH+FF+PSJ），共10組。成瘤小鼠共100只，隨機(jī)分入以上各組中，每組10只。分別給予生理鹽水、中藥組方灌胃，生理鹽水、紫杉醇注射液腹腔注射。觀察成瘤后第8天，荷瘤重量。并計算抑瘤率。結(jié)果：黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組腫瘤組織塊重量明顯小于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＝0.049＜0.05，該組抑瘤率為27.05%。結(jié)論：益氣藥、活血藥組合黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲，具有抑制乳腺腫瘤EMT6細(xì)胞在BABL／C小鼠體內(nèi)增值的作用。具有進(jìn)一步研究價值。

益氣；活血；乳腺癌；增殖

乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的惡性疾病。在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率居第三位［1］。近年來，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為益氣活血法是乳腺癌中醫(yī)藥診療的重要治法。獲得具有抗腫瘤作用的益氣藥、活血藥的適宜配伍，是進(jìn)一步研究益氣藥、活血藥抗乳腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，綜合文獻(xiàn)報道及臨床運(yùn)用實(shí)際，我們在本實(shí)驗(yàn)選取黃芪、蘇木、生蒲黃、蜂房、炮山甲為候選藥物，觀察其不同組合抗小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞在BAB／C小鼠體內(nèi)增殖能力的共性及差異，篩選適宜的益氣藥、活血藥組合。

1 材料

1.1 動物 BALB／C小鼠，雌性，6～8周齡，體重（20 ±2）g，SPF級，由北京嘉軒科技有限公司提供，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部SPF級屏障環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 藥物 黃芪浸膏，每克含生藥2.8g，生產(chǎn)批號：20080308。蘇木浸膏，每克含生藥0.4g，生產(chǎn)批號：20100122。生蒲黃浸膏，每克含生藥0.4g，生產(chǎn)批號：20091206。蜂房浸膏，每克含生藥0.24g，生產(chǎn)批號：20100106。以上藥物均由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑中心提供。炮山甲煎液，自制，每毫升約含生藥6g。紫素注射液，北京協(xié)和制藥廠，批號：101011。

1.3 細(xì)胞株 EMT6乳腺癌細(xì)胞，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系王露教授惠贈。

1.4 主要儀器 MLS-3750全自動消毒鍋，日本SANYO。SARTRIOUS電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。TE200-U倒置顯微鏡，日本NIKON。古威牌超凈工作臺，北京昌平長城空氣凈化工程公司。血細(xì)胞計數(shù)板，上海精密儀器儀表有限公司。

1.5 主要試劑 1640培養(yǎng)液，購自Hyclone公司。胎牛血清，購自Hyclone公司。青霉素、鏈霉素雙抗，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供。

2 方法

2.1 EMT6細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 液氮中取出EMT6細(xì)胞，迅速置入38℃溫水中，待凍存液融化，將凍存液轉(zhuǎn)移至盛有10mL培養(yǎng)液的15mL離心管內(nèi)，1000r／min離心5min，棄上清，2m L培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液至5mL，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，適時傳代。

2.2 EMT6細(xì)胞BALB／C小鼠荷瘤模型的建立 取傳代后24hEMT6細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞密度為70%左右，0.25%胰酶消化，培養(yǎng)基中和，10000r／min離心5min，3mL培養(yǎng)基重懸，臺盼藍(lán)染色并計數(shù)，調(diào)整活細(xì)胞密度為2×107個／mL，每只小鼠左側(cè)腋下接種0.1m L腫瘤細(xì)胞懸液。接種后第4天觀察，BALB／C小鼠左側(cè)腋下瘤塊直徑＞0.4cm為成瘤，模型建立成功。

2.3 分組及給藥 小鼠成瘤后，隨機(jī)分組，每組10只，處理方法如下：接種后第5天開始給予各組處理?？瞻讓φ战M予生理鹽水灌胃+生理鹽水腹腔注射；紫杉醇化療組予生理鹽水灌胃+紫杉醇腹腔注射；各治療組予與其分組名相同中藥組合湯劑灌胃+生理鹽水腹腔注射。其中：生理鹽水灌胃0.2mL／次，每日1次。生理鹽水腹腔注射液0.2mL／次，每日1次。紫杉醇注射液以生理鹽水稀釋，小鼠腹腔注射劑量30mg／kg，0.2mL／次，每日1次。不同試驗(yàn)組中藥復(fù)方灌胃，以生理鹽水配制灌胃湯劑，黃芪劑量5g／kg，蘇木劑量1.67g／kg，生蒲黃1.67g／kg，蜂房1.67g／kg，炮山甲1.67g／kg。

2.4 觀察指標(biāo) 瘤重和抑瘤率：于接種后第12天，即開始給藥干預(yù)后第8天，將每組小鼠處死，剝離腫瘤組織，稱取瘤重，計算抑瘤率。計算公式如下：

抑瘤率（%）＝［1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重（g）／對照組平均瘤重（g）］×100%

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。

表1 益氣活血藥不同拆方組合BALB／C荷瘤小鼠瘤重表

3 結(jié)果

經(jīng)Shapro-Wilk檢驗(yàn)，各組瘤重數(shù)值均符合正態(tài)分布。空白對照組（P＝0.503＞0.05）；紫杉醇組（P＝0.055＞0.05）；黃芪+蘇木組（P＝0.774＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃組（P＝0.145＞0.05）；黃芪+蘇木+蜂房組（P＝0.60837＞0.05）；黃芪+蘇木+炮山甲組（P＝0.398＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房（P＝0.478＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃+炮山甲組（P＝0.329＞0.05）；黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組（P＝0.568＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房+炮山甲組（P＝0.684＞0.05）。

Levene值＝1.206，P＝0.301，具有方差齊性。LSD法兩兩比較，空白對照組與其他處理組相比，其中黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＝0.049＜0.05。

表2 益氣活血藥不同拆方組合BALB／C荷瘤小鼠平均瘤重及抑瘤率表

圖1 益氣活血藥不同拆方組合BALB／C荷瘤小鼠平均瘤重圖

4 討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以初步確認(rèn)，益氣活血藥物（黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組合），在BALB／C小鼠活體內(nèi)具有抑制乳腺癌EMT6細(xì)胞生長的作用，表現(xiàn)出良好的深入研究苗頭。

據(jù)中醫(yī)理論分析，該組合具有益氣培本、活血通絡(luò)、軟堅(jiān)攻毒的作用。結(jié)合中醫(yī)學(xué)對腫瘤正虛邪實(shí)、瘀毒夾雜的病理特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)最終篩藥組合與中醫(yī)理論相符合。近年來，益氣活血法指導(dǎo)的中藥方劑抗腫瘤研究逐漸得到諸多學(xué)者重視與研究，并在臨床運(yùn)用和基礎(chǔ)研究中作了部分探索。王笑民等［2］從癥候?qū)W角度研究發(fā)現(xiàn)，108名非小細(xì)胞肺癌患者中有60.20%的患者存在不同程度的氣虛血瘀證，并提出T細(xì)胞亞群、血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α、纖維蛋白原及纖維蛋白溶解酶等指標(biāo)是改變氣虛血瘀證的病理生理基礎(chǔ)。徐詠梅等［3］報道，采用益氣活血法為指導(dǎo)組方的固本抑瘤Ⅱ號能增強(qiáng)化療療效，減輕化療毒副作用，并以血栓素、纖維蛋白原、6-酮-前列腺素F1α、纖溶酶等為指標(biāo)，觀察到益氣活血法可減輕腫瘤患者化療后的血液高凝狀態(tài)?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究方面，郝鈺、李東濤、李萍萍等［4-6］均報道，不同益氣活血組方對腫瘤均有一定的抑制作用。

本研究藥物組合中，黃芪為豆科黃芪屬植物的根。甘、溫，歸肺、脾經(jīng)。具有益氣升陽，固表止汗，利水消腫，托毒生肌等功效。《本經(jīng)》：主癰疽，久敗瘡，排膿止痛?！秳e錄》：逐五臟間之惡血?！侗静輦湟罚号拍搩?nèi)托，瘡癰圣藥。任美萍［7］等報道，黃芪多糖在體外以CCK-8法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其對K562、SMMC-7721、HCT116和A549細(xì)胞系無增殖抑制作用，而在體內(nèi)可以提高荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α水平，并抑制荷瘤小鼠體內(nèi)H22、S180腫瘤細(xì)胞的活性。張喜林［8］等報道，黃芪總提物能夠降低HepA肝癌荷瘤小鼠血清ALT、AST及ALP水平，提高淋巴細(xì)胞含量，并能抑制抑制瘤的生長。陳坤［9］等報道，一定體積分?jǐn)?shù)的黃芪注射液（3.45%和1.70%）具有促進(jìn)人食管癌細(xì)胞株TE-13生長的作用，并且該促進(jìn)作用有一定的計量依賴。

蘇木為豆科蕓實(shí)屬植物蘇木的心材。甘、咸、微辛、平。歸心、肝、大腸經(jīng)。具有活血祛瘀，消腫定痛等功效。《本草綱目》：三陰經(jīng)血分之藥。《醫(yī)學(xué)啟源》：破死血?！夺t(yī)林攥要》：補(bǔ)心散瘀，除血分妄作之風(fēng)熱。徐建華［10］等報道，蘇木提取液在體外能夠顯著促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。并可延長肝癌H22腹水小鼠的生存時間。

蜂房為胡蜂科胡蜂屬昆蟲黃星長腳黃蜂的巢。微甘、平、小毒，歸肝、胃、腎經(jīng)。具有攻毒消腫的功效?！侗静輩R言》：祛風(fēng)攻毒，散疔腫惡毒?！锻饪迫砑罚耗芡卸荆熅脻?，止痛。報道，蜂房提取物在體外對多種腫瘤細(xì)胞存在抗增殖活性，其可以通過降低Bcl-2蛋白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯。但是蜂房提取物在高濃度下對造血干細(xì)胞具有毒性作用，低濃度確促進(jìn)正常造血干細(xì)胞的增殖。［11］

炮山甲為鯪鯉科鯪鯉屬動物鯪鯉的鱗片。經(jīng)過鍋內(nèi)砂子武火炒熱，拌炒至鼓起并呈金黃色而成。咸，微寒。歸肝、胃經(jīng)。《本草綱目》：通經(jīng)絡(luò)。下乳汁，消癰腫，排膿血?！侗静菰傩隆罚航鉄釘《?。炮山甲抗腫瘤作用的現(xiàn)代研究較少，多為臨床經(jīng)驗(yàn)報道。

在本研究中，紫杉醇組設(shè)置為陽性對照，具有較好的抑瘤率，但是進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]為樣本量尚偏小所導(dǎo)致。單純從抑瘤率角度進(jìn)行分析，可以看到，具有炮山甲的藥組與除炮山甲外其余藥物均相同的藥物組，其抑瘤作用均為明顯。炮山甲是否能夠作為抗腫瘤生長中藥復(fù)方中的增效單味藥，值得繼續(xù)深入研究。結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，對于益氣活血藥單味中藥抗腫瘤作用的研究，如黃芪、蘇木等，具有學(xué)者發(fā)現(xiàn)劑量依賴等關(guān)系。因此，對于益氣活血藥物復(fù)方組合是否具有劑量依賴的抗腫瘤作用，仍然需要做大量的工作。

［1］周際昌.實(shí)用腫瘤內(nèi)科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：511.

［2］王笑民，郁仁存，王禹堂.晚期非小細(xì)胞肺癌患者氣虛血瘀證的研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1994，14（12）：724-726.

［3］徐詠梅，郁仁存.益氣活血法治療腫瘤經(jīng)驗(yàn).［J］.中醫(yī)雜志，2010，51（6）：110-111.

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［7］任美萍，劉明華，李蓉，等.黃芪多糖抗腫瘤活性研究［J］.中國新藥雜志，2010，19（3）：221-224.

［8］張喜林，孛文虎，李路勇，等.黃芪總提取物抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國現(xiàn)代藥物運(yùn)用，2010，4（4）：29-31.

［9］陳坤，高獻(xiàn)書，盧付河，等.黃芪、參芪促腫瘤生長作用的觀察［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，25（1）：33-34.

［10］徐建華，郭素堂，喬麗娟，等.蘇木提取液抑制腫瘤作用的研究［J］.腫瘤研究與臨床，2006，11（8）：726-727.

［11］張坤，魏金榮，關(guān)一夫.蜂房提取物中抗腫瘤成分的活性研究［J］.中醫(yī)雜志，2010，51（S2）：246-248.

（2013-10-30收稿）

A sp lit-side Research of Qi Boosting and Blood Quicken Formula’s Function in Inhibiting the Proliferation of Breast Cancer Cell EMT6 in a Tumor Burdened M ice M odel in Vivo

Wang Hui1，2，Du Xinyin1，2，3，Hua Baojin1，2，Sun Guizhi1，2
（1 Oncology Department of Guang’anmen Hospital affiliated to China Academy of ChineseMedicine Science，Beijing 100053，China；2 Cancer Institute of China Academy of Chinese Medicine Science，Beijing 100053，China；3 Northern Hospital of China North IndustriesGroup Corporation，Beijing 100089，China）

Objective：To get effective compatibility of Chinesemedicine herbs which would boost qi and quicken blood for inhibiting proliferation of breast cancer cells.And also to explore the connotation of herbs compatibility to treat cancer.M ethods：Breast cancer cell EMT6 burdened BALB／Cmicemodelwere established.Ten groupsweremade including control group（Control），Taxel group（Taxel），Huangqi+Sumu group（HQ+SM）；Huangqi+Sumu+Puhuang group（HQ+SM+PH）；Huangqi+Sumu+Fengfang（HQ+SM+FF）；Huangqi+Sumu+Paoshanjia（HQ+SM+PSJ）；Huangqi+Sumu+Puhuang+Fengfang（HQ+SM+PH+ FF）；Huangqi+Sumu+Puhuang+Paoshanjia（HQ+SM+PH+PSJ）；Huangqi+Sumu+Fengfang+Paoshanjia（HQ+SM +FF+PSJ）；Huangqi+Sumu+Fengfang+Fengfang+Paoshanjia（HQ+SM+PH+FF+PSJ）.100 tumor burden m ice were randomly divided into these ten groupswith tenmice in each group.Chinesemedicine formula and saline were administered intragastrically to different groups aswell as saline and Taxelwere given by interoperatoneal injection.The burdened tumorweightwasmeasured 8 days after forming the tumors and the tumor inhibition rate was observed.Results：The weight of burden tumor of the Huangqi+Sumu+ Fengfang+Paoshanjia group（HQ+SM+FF+PSJ）wasmuch smaller than thatof the control group.The differencewasstatistically significant，P＝0.049＜0.05.The tumor inhibition rat of（HQ+SM+FF+PSJ）group was 27.05%.Conclusion：The Chinesemedicine herbs compatibility with Huangqi，Sumu，F(xiàn)engfang and Paoshanjia has the function of inhibiting the proliferation of breast cancer cell EMT6 in BALB／Cm ice in vivo.

Yiqi；Huoxue；Breast cancer；Proliferation

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.022

國家自然科學(xué)基金（編號：81072970）

王輝，男，30歲，浙江人，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：中西結(jié)合腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究

孫桂芝，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，博士后合作導(dǎo)師，全國第四批名老中醫(yī)，研究方向：中西結(jié)合腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究，地址：北京市西城區(qū)北線閣5＃中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，郵編：100053，電話：010-88001192