羅 贛 徐 冰 劉 倩 李 洋 史新元 喬延江

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥信息工程研究中心，北京，100029）

基于QbD理念的丹參醇提工藝設(shè)計(jì)空間的建立與驗(yàn)證

羅 贛 徐 冰 劉 倩 李 洋 史新元 喬延江

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥信息工程研究中心，北京，100029）

目的：建立并驗(yàn)證丹參醇提工藝的設(shè)計(jì)空間。方法：以隱丹參酮、丹參酮IIA提取率為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），以乙醇濃度、乙醇倍量、煎煮時(shí)間為關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP），采用中心點(diǎn)復(fù)合設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，基于二次多項(xiàng)式回歸模型開發(fā)丹參醇提工藝設(shè)計(jì)空間。結(jié)果：方差分析結(jié)果顯示模型的P值均小于0.05，且失擬值均大于0.1，表明該模型可以較好的描述CQA和CPP之間的關(guān)系.設(shè)計(jì)空間以O(shè)verlay plot展示，在加入95%置信區(qū)間后，可縮小設(shè)計(jì)空間范圍并提高其可靠性。結(jié)論：基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念建立丹參醇提工藝設(shè)計(jì)空間可以提高工藝過程的穩(wěn)健性和靈活性。

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)；丹參；乙醇提??；設(shè)計(jì)空間；過程穩(wěn)健性

人用藥物注冊(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）于2005年出臺(tái)的ICH Q8［1］中提出了“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Quality by Design，QbD）”的理念，QbD是將科學(xué)的方法和風(fēng)險(xiǎn)管理的理念應(yīng)用于藥品工藝開發(fā)和生產(chǎn)全過程。實(shí)施QbD的核心之一在于為制劑工藝建立設(shè)計(jì)空間。在ICH Q8中設(shè)計(jì)空間被定義為：可以確保產(chǎn)品質(zhì)量的輸入變量（例如原材料的質(zhì)量屬性）和工藝參數(shù)之間的多維組合與相互作用。

目前，設(shè)計(jì)空間已應(yīng)用于化學(xué)藥品的干燥［2］、混合［3］、制粒［4］、包衣［5］等生產(chǎn)過程，以及生物制品的菌苗培養(yǎng)［6］等過程，但在中藥制劑生產(chǎn)過程中的應(yīng)用較少［7-8］。本文以丹參醇提過程作為研究對(duì)象，“將質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念和“設(shè)計(jì)空間”（Design space）的方法應(yīng)用于中藥提取過程，從設(shè)計(jì)層面保證丹參提取物的質(zhì)量，利用響應(yīng)面方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立基于QbD理念的丹參醇提工藝設(shè)計(jì)空間并進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

Agilent1100液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）、Sartorius BS210S天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

丹參飲片（購(gòu)自北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號(hào)20120402），對(duì)照品隱丹參酮、丹參酮IIA（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定所，批號(hào)分別為110852-200806和110766 -200619），乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 丹參提取物制備 取丹參飲片500 g，加乙醇回流提取2次，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮，80℃干燥，粉碎成細(xì)粉。

2.2 丹參藥材中隱丹參酮和丹參酮IIA的含量測(cè)定

1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取隱丹參酮、丹參酮IIA適量，以甲醇為溶劑，配置成濃度為含隱丹參酮30 μg／mL、丹參酮IIA 130μg／m L的混合對(duì)照品溶液。

2）供試品溶液的制備：取丹參粉末（過三號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

3）色譜條件：Agilent SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫25℃，流速1mL／min，流動(dòng)相為甲醇：水＝75：25，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

2.3 丹參醇提物中隱丹參酮和丹參酮IIA的含量測(cè)定 1）對(duì)照品溶液的制備：同2.2項(xiàng)下“對(duì)照品溶液的制備”。

2）供試品溶液的制備：取丹參醇提物約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液即得。

3）色譜條件：Agilent SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫25℃，流速1 mL／min，流動(dòng)相為乙腈-0.026%磷酸水溶液，梯度洗脫，梯度設(shè)置如表1，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

表1 梯度洗脫表

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）的確定：目標(biāo)成分隱丹參酮（Y1）和丹參酮IIA（Y2）的提取率作為CQA，乙醇濃度（A，80%～100%），乙醇倍量（B，6～12倍），煎煮時(shí)間（C，0.5～3小時(shí)）作為CPP。擬定工藝目標(biāo)為隱丹參酮和丹參酮IIA的提取率分別大于70%和50%。

2.4.2 中心點(diǎn)復(fù)合設(shè)計(jì) 利用Design expert8.0軟件安排20次實(shí)驗(yàn)（α值選擇1，中心點(diǎn)重復(fù)6次）。因素水平如表2所示。

表2 丹參醇提因素水平表（α＝1）

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 丹參藥材隱丹參酮和丹參酮含量測(cè)定結(jié)果本批次藥材中丹參中隱丹參酮含量為（2.9±0.00834）mg／g（n＝3），丹參酮IIA含量為（4.7±0.0221）mg／g（n＝3），藥材質(zhì)量符合藥典要求。

3.1.2 提取率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)中心點(diǎn)復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排進(jìn)行工藝操作，根據(jù)出膏率、丹參醇提物中隱丹參酮含量、丹參酮IIA含量計(jì)算隱丹參酮（Y1）、丹參酮IIA提取率（Y2），結(jié)果如表3。

表3 CCD實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表4 方差分析表-Y1

3.2 模型的建立及評(píng)價(jià)

3.2.1 模型的建立 采用二次多項(xiàng)式模型對(duì)兩個(gè)CQA（Y1，Y2）及相應(yīng)的CPP（A，B，C）分別進(jìn)行擬合，Y1和Y2的的回歸方程分別是：

二方程的擬合相關(guān)系數(shù)R2分別是0.7466和0.7595，表明響應(yīng)值Y1和Y2實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的的擬合度，因此可以使用此模型來預(yù)測(cè)隱丹參酮和丹參酮IIA提取率的實(shí)際情況。

3.2.2 方差分析 方差分析結(jié)果以Y1為例，如表4所示。

可以看出，對(duì)于Y1和Y2，模型的P值均小于0.05（顯著），且失擬值均大于0.1（不顯著），表明所建模型可靠，各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型函數(shù)化。乙醇濃度A，乙醇倍量B，煎煮時(shí)間C的P值均小于0.05，表明A、B、C三個(gè)因素對(duì)Y1，Y2具有顯著影響，且影響程度排序均為A＞B＞C。但AB，AC，BC的P值均小于0.05，表明A、B、C三個(gè)因素的交互作用對(duì)Y1，Y2的影響不顯著。

3.3 響應(yīng)面分析 以Y1為例，圖1為隱丹參酮的提取率隨乙醇濃度和乙醇倍量變化的響應(yīng)面圖，圖2為隱丹參酮的提取率隨乙醇濃度和煎煮時(shí)間變化的響應(yīng)面圖。

圖1 乙醇濃度和乙醇倍量對(duì)隱丹參酮（Y1）提取率影響的響應(yīng)面圖

圖2 乙醇濃度和煎煮時(shí)間對(duì)隱丹參酮（Y1）提取率影響的響應(yīng)面圖

由上圖可以直觀的看出，乙醇濃度A對(duì)于Y1和Y2的影響相比乙醇倍量B和煎煮時(shí)間C更大，與方差分析結(jié)果一致。在規(guī)定的范圍內(nèi)，乙醇濃度越高，煎煮時(shí)間越短，有效成分的提取率就越高，這也符合了隱丹參酮和丹參酮IIA兩種醇溶性成分遇熱不穩(wěn)定的特點(diǎn)［9］。

3.4 設(shè)計(jì)空間的建立 在設(shè)定的參數(shù)空間內(nèi)搜索同時(shí)滿足兩個(gè)目標(biāo)（Y1＞70%，Y2＞50%）的所有因素組合，即構(gòu)成設(shè)計(jì)空間，結(jié)果用Overlay Plot展示，如圖3所示。

圖3 不帶有置信區(qū)間的丹參醇提工藝的設(shè)計(jì)空間

由圖3可以看出，白色部分即為丹參醇提工藝的設(shè)計(jì)空間，但由于模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間存在一定差異，所以設(shè)計(jì)空間的邊界具有不確定性。為了應(yīng)對(duì)設(shè)計(jì)空間邊界的不確定性，在定義設(shè)計(jì)空間時(shí)可加入置信水平α＝0.05的置信區(qū)間，將設(shè)計(jì)空間優(yōu)化，結(jié)果應(yīng)用Overlay plot展示，如圖4所示。

圖4 加入95%置信區(qū)間的丹參醇提工藝的設(shè)計(jì)空間

由圖4可以看出，白色部分即為優(yōu)化后的設(shè)計(jì)空間，即整個(gè)空間內(nèi)所有的點(diǎn)的估計(jì)值都符合工藝目標(biāo)要求（Y1＞70%，Y2＞50%），深灰色部分屬于原有設(shè)計(jì)空間內(nèi)不可靠的部分，即此空間內(nèi)的估計(jì)值有5%的概率無法滿足原有的工藝目標(biāo)要求。

3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在圖4中選取5個(gè)不同區(qū)域內(nèi)的的點(diǎn)來做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，5點(diǎn)的選取如表5所示。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的選取

表6 設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，YZ1、YZ2和YZ5均符合預(yù)設(shè)要求。YZ3和YZ4中Y1＜70%，Y2＞50%，Y2均符合預(yù)設(shè)要求而Y1卻沒有達(dá)到，這表明由于95%置信區(qū)間的加入，相比未加入95%置信區(qū)間，設(shè)計(jì)空間邊界的不確定性得到了較好的印證。

4 結(jié)論

本文采用中心點(diǎn)復(fù)合設(shè)計(jì)對(duì)丹參醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化，并構(gòu)建了丹參醇提工藝的設(shè)計(jì)空間。加入95%置信區(qū)間后，設(shè)計(jì)空間的范圍有所縮小，提高了設(shè)計(jì)空間的可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于QbD理念建立丹參醇提設(shè)計(jì)空間可提高工藝過程的穩(wěn)健性和可靠性。

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（2013-10-30收稿）

Establishment and Verification of Design Space of Ethanol Extraction Process of Salvia M iltiorrhiza based on Quality by Design

Luo Gan，Xu Bing，Liu Qian，Li Yang，Shi Xinyuan，Qiao Yanjiang
（Research Center of TCM information Engineering，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective：To establish and verify the design space of ethanol extraction process of Salviamiltiorrhiza.Method：The extraction ratios of cryptotanshinone and Tanshinone IIA are identified as the critical quality attributes（CQAs），and ethanol concentration，ethanol amount，decoction time are identified as critical process parameters（CPPs）.The central composite design is used for experimental arrangements，and the design space of ethanol extraction process of Salviamiltiorrhiza is established based on the quadratic polynomial regressionmodel.Result：Since the p-values of bothmodels are less than 0.05 and values of lack of fit aremore than 0.1，the relationship between CQAs and CPPs could be well described by the twomodels.The reliability of design space，illustrated by overlay plot，is improved with the addition of 95%confidence.Conclusion：The robustness and flexibility of Salviamiltiorrhiza ethanol extraction process have been enhanced via the establishment of design space based on the quality by design（QbD）concept.

Quality by Design（QbD）；Salviamiltiorrhiza；Ethanol extraction process；Design Space；Process robustness

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.006

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目“中藥提取物化學(xué)、物理屬性的全息快速評(píng)價(jià)研究”（編號(hào)：532／0100604295）；2013年省部級(jí)“中藥基礎(chǔ)與新藥研究”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助

羅贛（1986—），男，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院

喬延江，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥信息學(xué)研究，北京市朝陽(yáng)區(qū)北三環(huán)東路11號(hào)，郵編：100029，E-mail：yjqiao＠263. net；徐冰，博士，講師，研究方向?yàn)橹兴幹扑庍^程分析與控制，郵編：100102，E-mail：btcm＠163.com