任士飛 張林吉 （徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 221006）

一例豬圓環(huán)與豬瘟混合感染的診治

任士飛 張林吉 （徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 221006）

2013年3月份，徐州沛縣某豬場暴發(fā)了奇異的病，很多即將斷奶的仔豬體溫不升高，死亡前兩天哆嗦，然后死亡。發(fā)病率62%，致死率83.3%，當(dāng)?shù)氐墨F醫(yī)不能確診，拿2只即將死亡的豬到本院尋求幫助。

1 臨床癥狀

畜主送來剛死亡但仍有體溫的豬。問診：發(fā)病前飲食很好，發(fā)病后飲食欲降低，糞便量減少。體表觀察：下眼瞼腫大，體表有出血斑點，也有很多很大的圓形斑塊，全部結(jié)痂，腹股溝淺淋巴結(jié)腫大。

2 病理變化

解剖檢查：心包積液，液體澄清透亮、黃色，肝不腫大，膽囊呈黃色，脾臟腫大呈紫黑色，肺臟輕微腫大，少部分肉變，胃壁有出血點，腸系膜嚴(yán)重充血，腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血，腸黏膜輕微出血，腎臟腫大，表面有小的出血點，皮質(zhì)部呈土黃色，有出血點，膀胱儲有黃色渾濁尿液。腹股溝淺淋巴結(jié)腫大、有漿液滲出，肩前淋巴結(jié)出血腫大。

3 實驗室診斷

3.1 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂平板，鮮血瓊脂平板，常用染色液由徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物微生物實驗室提供。

PCV2F AAGG GCTG GGTTATGGTATG CSFV2R TGATGCTGTCACACAGGTGAA 508 PCV2R CGCTGGAGAAGGAAAAATGG 353 CSFV2F GCTCCTGGT TGG TAACCTCGG

3.2 酶和試劑 RNA 反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTPs、DNA Marker購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠電泳染色劑Goldview購自賽百盛生物公司；蛋白酶K、SDS、T rizol試劑購自上海生工；生化鑒定試劑盒購自杭州天和微生物試劑有限公司。苯酚、氯仿、異戊醇及常用化學(xué)試劑為分析級。進行：取總RNA7μl，加入20μl反轉(zhuǎn)錄體系中，包括4μl反轉(zhuǎn)錄溶液，6μl dNTPs，1μl下游引物(50pmol/L)，1μl反轉(zhuǎn)錄酶和1μl RNase Inhibitor，用DEPC水補至20μl，42℃水浴1h，95℃5min后，冰浴5min，置-20℃?zhèn)溆谩?0μl體系，蒸餾水37.5μl、10xPCR Buffer5μl、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μl、Taq酶0.5μl、上游、下游引物各1μl、dNTPs 1μl。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，60℃退火1min，，72℃延伸1min，30個循環(huán);72℃延伸7min。取5μl PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

3.5 PCV2PCR檢測 （1）病毒總DNA的提?。翰捎梅勇确鲁樘岱ㄌ崛〔×现械腄NA，室溫干燥，加入20μl滅菌ddH2O，-20℃保存?zhèn)溆?。?）PCV2的PCR擴增：PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，58℃(PC V2)退火1min，72℃1min，30個循環(huán)，72℃延伸7min。取5μl PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

3.6 細菌分離鑒定 （1）病原分離培養(yǎng)及純化將收集的豬的肝臟病料接種于鮮血培養(yǎng)基上進行增菌培養(yǎng)，然后劃線接種在普通培養(yǎng)基上，于37℃溫箱中培養(yǎng)18～24h，觀察到菌落的形態(tài)及溶血類型。（2）生化試驗對純化細菌進行糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、果糖)、脲酶試驗、肌醇、觸酶試驗、氧化酶試驗、VP試驗，觀察結(jié)果。

4 結(jié)果與分析

4.1 檢測結(jié)果 PCR或RT-PCR檢測結(jié)果表明，PCV2和CSFV擴增為陽性，片段大小與預(yù)期相符，約353bp和，其他病毒檢測結(jié)果均為陰性(附圖)。

3.3 引物 參照文獻設(shè)計引物，引物由上海Invitrogen合成，用高壓滅菌ddH2O溶解配成10pmo1/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 CSFV的RT-PCR檢測 （1）1按Trizol試劑使用說明書提取樣品總RNA進行，加入20μl適量DEPC處理過的水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，-20℃保存?zhèn)溆谩＃?）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按Promega公司的使用說明書

附圖 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

4.2 細菌分離培養(yǎng)及染色、鏡檢結(jié)果 未檢測到細菌。

4.3 生化試驗結(jié)果 生化試驗均為陰性。

5 防治措施

5.1 隔離病豬群 根據(jù)具體情況對病豬進行分群，無害化處理病死豬，及時打掃圈舍，徹底消毒，將污物、糞便等消毒后堆積發(fā)酵。消毒劑要輪換使用，2次/d，連用3d，再后改為1次/d，連用3d。

5.2 緊急免疫 一豬一針頭，豬瘟兔化弱毒疫苗，25日齡內(nèi)豬1頭份/頭，25日齡以上豬2頭份/頭，母豬4頭份/頭。藥物治療，一個治療周期為5d。（1）采用抗菌藥物，如氟苯尼考、丁胺卡那藥物進行肌注；（2）采用黃芪多糖注射液配合維生素B1、B12和維生素C肌肉注射；（3）選用新型的抗病毒藥物，如輕移因子、干擾素等進行治療；（4）對尚有食欲的，投入多汁青綠飼料，用蒽諾沙星+黃芪多糖粉劑拌料，飼喂1周。

6 小結(jié)

（1）堅持自繁自養(yǎng)和全進全出制度，外購豬要嚴(yán)格檢疫，隔離觀察，隔離飼養(yǎng)1個月，檢查確認(rèn)無病后方可入群。（2）豬圓環(huán)病毒病、豬瘟為免疫抑制性疾病，目前尚無特效藥物。因此，有一定規(guī)模的養(yǎng)豬戶，必須堅持“預(yù)防為主，防重于治”的原則，并制定合理科學(xué)的免疫程序，嚴(yán)格按程序進行全面預(yù)防接種。（3）規(guī)?；B(yǎng)豬戶必須健全獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度。一定要按照防疫要求，做好環(huán)境衛(wèi)生工作，嚴(yán)格消毒、藥物預(yù)防等綜合性防治措施，才能有效避免疫病的侵入。（4）目前規(guī)?；B(yǎng)豬戶疾病發(fā)生常常是多種疾病混合感染。作為規(guī)?；B(yǎng)豬戶和技術(shù)人員，一定要了解國內(nèi)外疫病的流行動態(tài)，及時掌握新的防治手段，才能做到防病于未然。

S858.28

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1007-1733(2013)09-0035-02

2013–06–27）