何利兵王險(xiǎn)峰王紅勝杜軍張繼民

1.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州 510260；

2.中山大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化制藥實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

姜黃素衍生物體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖侵襲作用

何利兵1王險(xiǎn)峰2王紅勝2杜軍2張繼民1

1.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州 510260；

2.中山大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化制藥實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

背景與目的：姜黃素(curcumin)是從天然植物姜黃中提取的酚類化合物，已證實(shí)其具有抗惡性腫瘤作用。近年人工合成的姜黃素衍生物被認(rèn)為抗癌作用和生物利用度優(yōu)于母體姜黃素，但是對于結(jié)腸癌細(xì)胞的作用鮮見報(bào)道。研究旨在比較天然植物姜黃素及其4種人工合成的衍生物T316、T62、T63、T6F4對結(jié)直腸癌細(xì)胞株Lovo和SW480的細(xì)胞毒性作用、增殖遷移抑制作用和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活性表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系Lovo和SW480，然后通過MTT分析檢測姜黃素及4種衍生物對結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo和SW480細(xì)胞毒性影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移抑制作用；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測對癌細(xì)胞克隆增殖影響；流式細(xì)胞技術(shù)檢測對癌細(xì)胞凋亡的影響；并通過熒光素酶雙報(bào)告基因法檢測姜黃素及其衍生物對NF-κB活性表達(dá)的影響。結(jié)果：姜黃素對Lovo和SW480的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分別為(14.2±0.2)μmol/L和(10.6±0.7)μmol/L，分別是4種衍生物對Lovo和SW480的7.0～8.7倍和5.7～7.8倍(P＜0.01)。不加任何藥物時(shí)，Lovo 24 h遷移距離為(160.7±18.4)μm，SW480為(389.9±8.9)μm，但加入姜黃素及4種衍生物后，細(xì)胞遷移距離均明顯縮短，距離最短是T63作用于Lovo時(shí)的(53.2±11.7)μm；T316作用于SW480時(shí)的(80.4±9.6)μm。4種衍生物的遷移距離明顯短于姜黃素的遷移距離(P＜0.05)。4種衍生物在抑制2株結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成方面也明顯優(yōu)于姜黃素母體(P＜0.05)。通過流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，姜黃素及4種衍生物誘導(dǎo)Lovo的凋亡率分別為(10.05±0.54)%、(55.32±2.86)%、(31.83±0.85)%、(26.01±0.44)%、(21.44±3.01)%，高于對照組的凋亡率(6.98±0.23)%(P＜0.05)；且4種衍生物誘導(dǎo)凋亡作用優(yōu)于姜黃素(P＜0.05)。熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果表明，姜黃素及其4種衍生物能下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論：姜黃素和4種衍生物均能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖遷移力，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，但4種衍生物的作用明顯優(yōu)于母體姜黃素。

姜黃素衍生物；結(jié)直腸癌；增殖；遷移；凋亡

結(jié)直腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，在我國大城市發(fā)病率已躍居惡性腫瘤第3位。盡管外科手術(shù)方法及化療藥物不斷進(jìn)展，但術(shù)后癌灶的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致5年生存率仍達(dá)65%［1］。傳統(tǒng)的化療藥物由于具有強(qiáng)大的骨髓抑制和消化道反應(yīng)等使用藥劑量和時(shí)間均受到限制，迫切需要開發(fā)新的不良反應(yīng)小的抑制癌細(xì)胞遷移增殖藥物來防止腫瘤復(fù)發(fā)。姜黃素(curcumin)是從天然植物姜黃中提取的一種酚類化合物，已有文獻(xiàn)報(bào)道，姜黃素能通過抑制腫瘤血管生成對多種腫瘤的生長起抑制作用［2-6］。也有研究證實(shí)，姜黃素能通過干擾細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制前列腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［7-8］。實(shí)驗(yàn)動物模型及臨床實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，姜黃素對結(jié)直腸癌的發(fā)生有預(yù)防作用［4,9-10］。近年來人工合成了多種姜黃素的衍生物，證明其抗癌效果和生物利用度優(yōu)于姜黃素母體。但姜黃素及其衍生物對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和微癌灶克隆增殖的影響目前尚知之甚少。本實(shí)驗(yàn)主要以人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo和SW480為靶細(xì)胞，探討姜黃素及其4種合成的衍生物T316、T62、T63、T6F4在體外對癌細(xì)胞克隆增殖、遷移、凋亡的影響及發(fā)揮效應(yīng)的初步分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo和SW480購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。2株細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞接種24 h后進(jìn)入指數(shù)增長期。

1.2 藥物制備

姜黃素和4種姜黃素衍生物T316、T62、T63、T6F4(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)由中山大學(xué)藥學(xué)院杜軍和卜憲章教授實(shí)驗(yàn)室提供。衍生物T316、T62、T63、T6F4由該實(shí)驗(yàn)室合成［11］。姜黃素及其衍生物均用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成終濃度為10 mmol/L的母液，過濾除菌，避光存儲于-20 ℃冰箱備用。

1.3 試劑與設(shè)備

四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、碘化丙啶(PI)、腫瘤壞死因子(TNF-α)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒和載體(pRL-TK)購于Promager公司，質(zhì)粒(pNF-KB-Lue)由中山大學(xué)藥學(xué)院杜軍教授實(shí)驗(yàn)室提供。新生牛血清(NCS)、RPMI-1640培養(yǎng)基粉末、胰酶均為Gibco公司產(chǎn)品。DU 530分光光度儀購自Beckman coulter公司。

1.4 MTT分析

圖 1 姜黃素及4種衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The chemical structural formula of curcumin and its 4 derivatives

MTT法觀察姜黃素、T316、T62、T63、T6F4對Lovo株和SW480株細(xì)胞增殖抑制作用。將處于對數(shù)生長期的Lovo、SW480細(xì)胞，分別以每孔5×103、7×103的濃度接種于96孔板。設(shè)置不加藥對照組、和分別加姜黃素、T316、T62、T63、T6F4的5個(gè)加藥組，共6組。加藥組每組設(shè)9個(gè)藥物濃度梯度(0.125 μmol/L～32 μmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔中加入MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，37 ℃繼續(xù)溫育4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔中加入150 μL DMSO振蕩15 min后利用酶標(biāo)儀檢測各孔在570 nm波長處的吸光度值A(chǔ)570，然后計(jì)算相對抑制率。相對抑制率(%)=［1-(對照組A570-實(shí)驗(yàn)組值A(chǔ)570)/對照組］×100%。并計(jì)算2株大腸癌細(xì)胞對姜黃素及4種衍生物的半數(shù)有效抑制量(IC50)。

1.5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

將培養(yǎng)至指數(shù)期的Lovo、SW480細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL。以每孔500 μL的細(xì)胞懸液加入24孔板，放入培育箱。第2天，采用10 μL槍頭沿?zé)o菌直尺垂直孔底做劃線處理，棄去培養(yǎng)基，再用無菌PBS液漂洗3次，去除被劃下的細(xì)胞后，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入含濃度為0.5 μmol/L的姜黃素、T316、T62、T63、T6F4的無血清培養(yǎng)基，對照組只加入同體積的無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于0和24 h采集相同點(diǎn)的圖像。每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。

1.6 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)

鋪下層軟瓊脂：把1.2%的低熔點(diǎn)軟瓊脂和含20% NCS的2×RPMI 1640培養(yǎng)基等體積混合制備0.6%的下層軟瓊脂，并以每孔100 μL鋪于96孔板中，放室溫凝固后備用；上層軟瓊脂的制備：把0.6%的低熔點(diǎn)軟瓊脂和含20% NCS 的2×RPMI 1640培養(yǎng)基等體積混合成濃度0.3%的上層軟瓊脂；0.25%的胰蛋白酶分別消化Lovo、SW480細(xì)胞后離心，以制備的上層軟瓊脂重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 500/mL，以每孔100 μL鋪于已制備好鋪有下層軟瓊脂的96孔板當(dāng)中，室溫凝固，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分組設(shè)置同細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。培育2周后，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各組每孔形成細(xì)胞數(shù)＞50個(gè)或直徑＞50 μm的克隆團(tuán)。每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。

1.7 流式細(xì)胞技術(shù)檢測5種藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡影響

采用PI單染流式細(xì)胞技術(shù)分析法，取對數(shù)生長期Lovo、SW480細(xì)胞，消化后用含0.5% NCS的培養(yǎng)基調(diào)至密度為1×105/mL，以每孔500 μL接種于24孔板，置培育箱培育24 h。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入含濃度為1 μmol/L的姜黃素、T316、T62、T63、T6F4的無血清培養(yǎng)基，對照組只加入同體積的無血清培養(yǎng)基。培育24 h后0.25%胰蛋白酶消化，與培養(yǎng)上清液合并收集，4 000 r/min離心5 min。經(jīng)過2次PBS離心洗滌，加入PI(終濃度50 g/mL)避光4 ℃染色30 min后，利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率(前G1期細(xì)胞百分率)。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因法檢測NF-κB活性

消化處于對數(shù)生長期的Lovo株細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105/mL，以每孔100 μL鋪于96孔板，培養(yǎng)24 h，依照LipofectamineTM2000說明書，將等量的pNF-κB-Lue和pRL-TK轉(zhuǎn)入細(xì)胞，培育4～6 h后，換不含或含有20 ng/mL TNF-α及1 μmol/L的姜黃素、T316、T62、T63、T6F4的完全培養(yǎng)基。培育24 h后，檢測核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。熒光素酶活性的檢測依照Promega公司的Dua1-Lueiferase Reporter Assay System試劑盒說明進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 5種藥物對Lovo和SW480增殖抑制作用

姜黃素對2株結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制率呈劑量依賴性，但最大抑制率需藥物劑量到達(dá)30 μmol/L以上。而4種衍生物在藥物劑量達(dá)到10 μmol/L后其抑制作用基本達(dá)到高峰，再增加藥物濃度其抑制率也無明顯改變，且最大抑制率明顯高于姜黃素(圖2)。通過計(jì)算姜黃素和4種衍生物對2株結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50后發(fā)現(xiàn)，4種衍生物對2株結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于姜黃素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

2.2 5種藥物對Lovo和SW480細(xì)胞遷移的影響

在0及24 h分別拍攝對照組和實(shí)驗(yàn)組同一區(qū)域細(xì)胞遷移情況(圖3)。各組細(xì)胞在24 h內(nèi)的遷移距離(表2)。結(jié)果表明，用0.5 μmol/L的姜黃素及其衍生物處理的結(jié)腸癌細(xì)胞24 h內(nèi)的遷移距離短于未處理組癌細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。并發(fā)現(xiàn)4種衍生物抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移作用優(yōu)于姜黃素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但4種衍生物之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖 2 姜黃素及其衍生物對Lovo細(xì)胞和SW480細(xì)胞的抑制增殖曲線Fig. 2 The proliferation inhibition curve of curcumin and its derivatives on Lovo cells and SW480 cells

表 1 姜黃素及4種衍生物對Lovo和SW480的IC50Tab. 1 The IC50values of curcumin and its 4 derivatives on Lovo and SW480 cells

圖 3 Lovo and SW480細(xì)胞劃痕后遷移Fig. 3 The migration distance of Lovo and SW480 after 24 h

表 2 24 h后各組細(xì)胞遷移距離Tab. 2 The cell migration distance for each group after 24 h

2.3 5種藥物對Lovo和SW480細(xì)胞克隆形成影響

細(xì)胞培養(yǎng)2～3周后拍攝每組癌細(xì)胞的克隆情況(圖4)。通過計(jì)數(shù)每組細(xì)胞數(shù)＞50個(gè)或直徑＞50 μm的細(xì)胞克隆團(tuán)來比較各組之間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，應(yīng)用0.5 μmol/L姜黃素及4種衍生物后，細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少，克隆團(tuán)體積小。與對照組相比，5種藥物用于2株細(xì)胞后，克隆數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中應(yīng)用4種衍生物的克隆數(shù)也明顯少于應(yīng)用姜黃素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 5種藥物對Lovo和SW480細(xì)胞凋亡影響

PI染色流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示，用濃度為1 μmol/L的T316、T62、T63、T6F4、姜黃素作用24 h后測得各組細(xì)胞凋亡率分別為(55.32±2.86)%、(31.83±0.85)%、(26.01±0.44)%、(21.44±3.01)%、(10.05±0.54)%，高于對照組凋亡率(6.98±0.23)%，其中4種衍生物與對照組及姜黃素組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對照組與姜黃素組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，4種衍生物中T316對細(xì)胞凋亡的影響最為明顯(圖5)。

表 3 各組細(xì)胞的克隆數(shù)Tab. 3 Comparison of cell clonal proliferation among groups

圖 4 Lovo細(xì)胞和SW480細(xì)胞的克隆增殖情況Fig. 4 The clonal proliferation of Lovo and SW480

圖 5 各組細(xì)胞的凋亡情況Fig. 5 The apoptosis of Lovo cell

2.5 5種藥物對Lovo細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性影響

5種藥物作用對Lovo細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性試驗(yàn)結(jié)果表明，TNF-α能明顯增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)活性；而濃度為0.5 μmol/L的T316、 T62、T63、T6F4、姜黃素能顯著下調(diào)在TNF-α激活NF-κB通路條件下NF-κB的表達(dá)活性(圖6)。

圖 6 姜黃素及4種衍生物對Lovo細(xì)胞內(nèi)NF-κB相對活性的影響Fig. 6 The effect of curcumin and its derivatives on NF-κB activity

3 討 論

結(jié)直腸癌主要通過手術(shù)治療，但化療藥物也是不可缺少的輔助手段?；煵粌H能使原發(fā)癌腫縮小，而且還能減少術(shù)后癌灶的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。而結(jié)直腸癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是患者主要的死亡因素。目前使用的化療藥物雖然種類繁多，但尚無既能達(dá)到療效而不良反應(yīng)也輕的藥物。而自然界中存在許多天然活性植物化合物對多種腫瘤具有預(yù)防作用，且對腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用［12］。姜黃素是從天然植物姜黃中提取的一種酚類化合物，具有抗炎及抗氧化雙重作用［12-14］。1985年Kuttan首次提出姜黃素可能具有抗腫瘤作用［15］。后來在多種動物模型實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)姜黃素還能抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移［16-20］。人體每天攝入的安全劑量可高達(dá)10 g，在臨床實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)其劑量限制性毒性［21-24］，目前已被Ⅰ期臨床試驗(yàn)證明為一種無毒、安全的抗腫瘤藥物［25］，美國國立腫瘤研究所也將它列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥［26］。然而姜黃素水溶性差、易水解、不穩(wěn)定，口服吸收后迅速被肝臟代謝，首過消除現(xiàn)象明顯［27］。由于其生物利用度低僅能用于結(jié)直腸癌的預(yù)防作用，還不足以直接作為抗結(jié)直腸癌的藥物。而姜黃素的衍生物能有效提高其生物利用度，增強(qiáng)抗腫瘤效能，有望成為抗結(jié)直腸癌的安全有效藥物。T316、T62、T63、T6F4是中山大學(xué)藥學(xué)院合成的一類新型4-芳基亞甲基姜黃素類似物中的4種，前期研究發(fā)現(xiàn)此類4-芳基亞甲基姜黃素類似物對肺腺癌細(xì)胞株A549、H1944、肺鱗狀細(xì)胞癌株H157等多株肺癌細(xì)胞的毒性作用比姜黃素對肺癌細(xì)胞的毒性作用提高10～60倍，而且濃度僅需姜黃素的十分之一左右［11］。Cen等［28］也發(fā)現(xiàn)，姜黃素衍生物FLLL-11、FLLL-12及GO-Y030能將姜黃素抑制人類結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的效能提高5～20倍。本研究結(jié)果表明，姜黃素及其衍生物能抑制Lovo及SW480細(xì)胞克隆增殖和遷移，并且誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，但4種衍生物明顯強(qiáng)于母體姜黃素。在0.125 ～8 μmol/L濃度范圍內(nèi)，4種衍生物對2株大腸癌細(xì)胞的抑制增殖力呈濃度依賴性。在8 μmol/L條件下，4種衍生物對2株結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)已基本達(dá)到最大，再提高濃度對癌細(xì)胞的抑制增殖力影響不大。姜黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo和SW480的IC50分別為4種衍生物的7.0～8.7倍和5.7～7.8倍(P＜0.01)，而4種姜黃素衍生物之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

癌細(xì)胞的遷移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步；而單一癌細(xì)胞的克隆增殖是轉(zhuǎn)移癌灶形成的必要條件。因此，癌細(xì)胞的遷移及單一癌細(xì)胞的克隆增殖力與癌腫轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。雖然癌細(xì)胞在人體這個(gè)復(fù)雜環(huán)境內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖受多因素的影響，本研究通過細(xì)胞遷移和凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在離體條件下姜黃素及衍生物能影響癌細(xì)胞的遷移及增殖。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果也表明，在抑制增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡上，4種衍生物比姜黃素更具優(yōu)越性。

細(xì)胞通過跨膜信號傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)胞外信息傳入或胞間通訊，若參與此過程的細(xì)胞因子或分子發(fā)生變化，則可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。姜黃素之所以能抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，與其能作用于細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如NF-κB有關(guān)。NF-κB是一種能與免疫球蛋白輕鏈基因的增強(qiáng)子κB 序列特異結(jié)合的蛋白因子，廣泛存在于真核生物中，與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［29］。NF-κB能抑制凋亡相關(guān)分子Caspase-8的活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［30］。本研究就姜黃素對NF-κB通路的影響做了初步探討。結(jié)果提示姜黃素及4種衍生物均能下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。但具體作用于通路中何種因子發(fā)揮抗癌作用尚需進(jìn)一步研究。

總之，姜黃素4種衍生物為人工合成，來源方便，且抗細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性作用均優(yōu)于母體姜黃素，有望成為新型人工合成的抗癌藥物。

［1］ GATTA G, CICCOLALLO L, CAPOCACCIA R, et al. Differences in colorectal cancer survival between European and US populations： the importance of sub-site and morphology ［J］. Eur J Cancer, 2003, 39(15)： 2214-2222.

［2］ AGGARWAL B, Shishodia S. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer ［J］. Biochem Pharmacol, 2006, 71(10)： 1397-1421.

［3］ HANIF R, QIAO L, SHIFF S J, et al. Curcumin, a natural plant phenolic food additive, inhibits cell proliferation and induces cell cycle changes in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandin-independent pathway ［J］. J Lab Clin Med, 1997, 130(6)： 576-584.

［4］ KAWAMORI T, LUBET R, STEELE V E, et al. Chemopreventive effect of curcumin, a naturally occurring anti-inflammatory agent, during the promotion/progression stages of colon cancer ［J］. Cancer Res, 1999, 59(3)： 597-601.

［5］ AZUINE M A, BHIDE S V. Chemopreventive effect of turmeric against stomach and skin tumors induced by chemical carcinogens in Swiss mice ［J］. Nutr Cancer, 1992, 17(1)：77-83.

［6］ AZUINE M A, BHIDE S V. Protective single/combined treatment with betel leaf and turmeric against methyl (acetoxymethyl) nitrosamine-induced hamster oral carcinogenesis ［J］. Int J Cancer, 1992, 51(3)： 412-415.

［7］ CHAUDHARY L R, HRUSKA K A. Inhibition of cell survival signal protein kinase B/Akt by curcumin in human prostate cancer cells ［J］. J Cell Biochem, 2003, 89(1)： 1-5.

［8］ NARAYAN S. Curcumin, a multi-functional chemopreventive agent, blocks growth of colon cancer cells by targeting betacatenin-mediated transactivation and cell-cell adhesion pathways ［J］. J Mol Histol, 2004, 35(3)： 301-307.

［9］ HATCHER H, PLANALP R, CHO J, et al. Curcumin： From ancient medicine to current clinical trials ［J］. Cell Mol Life Sci, 2008, 65(11)： 1631-1652.

［10］ KELLOFF G J, CROWELL J A, STEELE V E, et al. Progress in cancer chemoprevention： development of diet-derived chemopreventive agents ［J］. J Nutr, 2000, 130(2S Suppl)：467-471.

［11］ QIU X, DU Y, LOU B, et al. Synthesis and identification of new 4-arylidene curcumin analogues as potential anticancer agents targeting nuclear factor-κB signaling pathway ［J］. J Med Chem, 2010, 53(23)： 8260-8273.

［12］ AGGARWAL B, SHISHODIA S. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer ［J］. Biochem Pharmacol, 2006, 71(10)： 1397-1421.

［13］ HANIF R, QIAO L, SHIFF S J, et al. Curcumin, a natural plant phenolic food additive, inhibits cell proliferation and induces cell cycle changes in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandin-independent pathway ［J］. J Lab Clin Med, 1997, 130(6)： 576-584.

［14］ SHI M, CAI Q, YAO L, et al. Antiproliferation and apoptosis induced by curcumin in human ovarian cancer cells ［J］. Cell Biol Int, 2006, 30(3)： 221-226.

［15］ MENON L G, KUTTAN R, KUTTAN G. Inhibition of lung metastasis in mice induced by B16F10 melanoma cells polyphenolic compounds ［J］. Cancer Lett, 1995, 16; 95(1-2)： 221-225.

［16］ AGGARWAL B B, SHISHODIA S, TAKADA Y, et al. Curcumin suppresses the paclitaxel induced nuclear factorkappaB pathway in breast cancer cells and inhibits lung metastasis of human breast cancer in nude mice ［J］. Clin Cancer Res, 2005, 11(20)： 7490-7498.

［17］ BACHMEIER B, NERLICH A G, IANCU C M, et al. The chemopreventive polyphenol Curcumin prevents hematogenous breast cancer metastases in immunodeficient mice ［J］. Cell Physiol Biochem, 2007, 19(1-4)： 137-152.

［18］ IKEZAKI S, NISHIKAWA A, FURUKAWA F, et al. Chemopreventive effects of curcumin on glandular stomach carcinogenesis induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine and sodium chloride in rats ［J］. Anticancer Res, 2001, 21(5)： 3407-3411.

［19］ FRANK N, KNAUFT J, AMELUNG F, et al. No prevention of liver and kidney tumors in Long-Evans Cinnamon rats by dietary curcumin, but inhibition at other sites and of metastases ［J］. Mutat Res, 2003, 523-524：127-135.

［20］ GURURAJ A E, BELAKAVADI M, VENKATESH D A, et al. Molecular mechanisms of anti-angiogenic effect of curcumin［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 297(4)： 934-942.

［21］ AGGARWAL B, KUMAR A, BHARTI A. Anticancer potential of curcumin： preclinical and clinical studies ［J］. Anticancer Res, 2003, 23(1A)： 363-398.

［22］ SHARMA R, EUDEN S, PLATTON S, et al. Phase Ⅰ clinical trial of oral curcumin： biomarkers of systemic activity and compliance ［J］. Clin Cancer Res, 2004, 10(20)： 6847-6854.

［23］ HSU C H, CHENG A L. Clinical studies with curcumin ［J］. Adv Exp Med Biol, 2007, 595： 471-480.

［24］ HANAI H, IIDA T, TAKEUCHI K, et al. Curcumin maintenance therapy for ulcerative colitis： randomized, multicenter, double-blind, placebo-controlled trial ［J］. Clin Gastroenterol Hepatol, 2006, 4(12)： 1502-1506.

［25］ CHENG A L, HSU C H, LIN J K, et al. Phase I clinical trial of curcumin, a chemopreventive agent, in patients with highrisk or pre-malignant lesions ［J］. Anticancer Res, 2001, 21(4B)： 2895-2900.

［26］ NCI, DCPC Chemoprevenion Branch and Agent Development Committee. Clinical development plan： curcumin ［J］. J Cell Biochem, 1996, 26(Suppl)： 72-85.

［27］ ANAND P, KUNNUMAKKARA A B, NEWMAN R A, et al. Bioavailability of curcumin： problems and promises ［J］. Mol Pharm, 2007, 4(6)： 807-818.

［28］ CEN L, HUTZEN B, BALL S, et al. New structural analogues of curcumin exhibit potent growth suppressive activity in human colorectal carcinoma cell ［J］. BMC Cancer, 2009, 9：99.

［29］ AGGARWAL B B, TAKADA Y, SHISHODIA S, et al. Nuclear transcription factor NF-kappa B： role in biology and medicine［J］. Indian J Exp Biol, 2004, 42 (4)： 341-353.

［30］ LI H L, CHEN D D, LI X H, et al. Changes of NF-κB, p53, bc1-2 and caspase in apoptosis induced by JTE-22 in human gastric adenocarcinoma cell line AGS cells： role of reactive oxygen species ［J］. World J Gastroenterol, 2002, 8(3)： 431-435.

《中國癌癥雜志》舉辦繼續(xù)教育函授班通知

經(jīng)本刊編委會討論決定，本刊從2012年下半年起舉辦2013年度繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育函授班。具體方法如下：

一、2012年第7期起開設(shè)2013年度函授繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育專欄，本年度的主要內(nèi)容包括：乳腺癌、肺癌、腸癌的病理診斷、放射治療及內(nèi)外科治療等。每期刊登1講，共12講，2013年第6期刊登考試試題，第7期刊登正確答案，要求學(xué)員認(rèn)真閱讀講座后答題，并將答案寄至編輯部（復(fù)印無效），考卷經(jīng)專人統(tǒng)一審閱，合格者授予Ⅱ類繼續(xù)教育學(xué)分10分，學(xué)分證書由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頒發(fā)。

二、參加對象：所有正在從事醫(yī)學(xué)專業(yè)技術(shù)工作的衛(wèi)生技術(shù)人員。預(yù)參加者請寫好本人姓名、年齡、性別、職稱、職務(wù)、學(xué)歷、選派單位名稱（地址及郵政編碼）、所在科室、聯(lián)系電話等寄往本編輯部（E-mail：zgaz@chinajournal.net.cn；zgazzz@163.com），同時(shí)通過郵局匯款（單位名稱：《中國癌癥雜志》編輯部；地址：上海市徐匯區(qū)東安路270號）的方式支付函授教育費(fèi)，并請?jiān)趨R款備注中注明“2013年度函授繼續(xù)教育”。編輯部收到學(xué)員報(bào)名和函授教育費(fèi)后編號登記注冊，隨即寄出注冊費(fèi)發(fā)票，并按時(shí)寄上每期刊物。即日起開始報(bào)名。

三、學(xué)員每人收費(fèi)200元，贈送12期雜志。編輯部依據(jù)學(xué)員報(bào)名登記注冊編號、交費(fèi)記錄和考試成績于2013年8月30日以前寄發(fā)學(xué)分證書。

四、為保證函授教育質(zhì)量，編委會邀請有關(guān)專家進(jìn)行出題、閱卷工作，編輯部設(shè)專人負(fù)責(zé)。咨詢電話：021-64188274；傳真：021-64043766；郵編：200032；聯(lián)系人：王露。歡迎廣大醫(yī)務(wù)人員踴躍參加。

Inhibitory effects of curcumin derivatives on proliferation and invasion of human colon cancer cell line Lovo and SW480

HE Li-bing1, WANG Xian-feng2, WANG Hong-sheng2, DU Jun2, ZHANG Jimin1(1.Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Guangdong 510260, China; 2.Department of Microbial and Biochemical Pharmacy, School of Pharmaceutical Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong 510006, China)

ZHANG Ji-min E-mail: jimin0820@163.com

Background and purpose:Curcumin is a phenolic compound extracted from the natural plant turmeric, which confer an antitumor effect. Recently, it was found that some curcumin derivatives also possessed the inhibiting effects on tumor angiogenesis and metastasis, even stronger than curcumin itself. However, no study dealing with their anticancer effect on colorectal cancer cells in vitro has been reported by far. This study aimed to investigate the roles of curcumin and its 4 derivatives, T316, T62, T63, and T6F4 in the proliferation and invasion of human colon cancer cell line Lovo and SW480. Methods:The inhibitory effects of curcumin and novel structural analogues T316, T62, T63, and T6F4 in 2 kinds of human colorectal cancer cell lines, SW480 and Lovo were investigated by MTT-based assay, Scratch-wound assay, soft agar colony formation assay, and flow cytometry. The transcriptional activityof NF-κB promoter was detected by luciferase assay. Results:The IC50of curcumin were (14.2±0.20) μmol/L and (10.6±0.70) μmol/L on Lovo and SW480, respectively, which were 7.0-8.7 folds, and 5.7-7.8 folds, significantly greater than its 4 derivatives in same cell lines (P＜0.01). The results of Scratch-wound assay revealed that there was a significant reduction within 24 h of cell migration distance in 4 derivative-groups compared with the cucurmin group (160.7±18.4) μm for Lovo, and (389.9±8.9) μm for SW480, respectively (P＜0.05). Soft agar colony formation assay showed a significant reduction in cloning number of 4 derivative-groups (P＜0.05) compared with the cucurmin group (60±8 for Lovo and 75±5 for SW480), respectively. The proportion of apoptosis of Lovo cell exposure to 4 derivatives were (55.32±2.86)%, (31.83±0.85)%, (26.01±0.44)%, (21.44±3.01)% in T316, T62, T63, and T6F4, respectively, which were significantly higher than control (6.81±0.23)% and curcumin group (10.05±0.54)% (P＜0.05). Luciferase assays also showed that treatment with curcumin or its 4 derivatives could inhibit NF-κB activation which induced by TNF-α. Conclusion:Curcumin and its 4 derivatives could inhibit proliferation and migration ability of colorectal cancer cells lines Lovo and SW480, and promoted cells apoptosis. Furthermore, the effects of 4 derivatives were significantly stronger than curcumin itself.

Curcumin derivatives; Colorectal cancer; Proliferation; Migration; Apoptosis

R735.3

：A

：1007-3639(2013)01-0017-09

2012-03-15

2012-12-01）

國家自然科學(xué)基金(No:81071883；No:30873032)。

張繼民 E-mail:jimin0820@163.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.01.003