一株活性細(xì)菌的抑菌活性研究

朱紅霞,李良娟,胡林峰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

一株活性細(xì)菌的抑菌活性研究

朱紅霞,李良娟,胡林峰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

以實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的一株細(xì)菌（ZXK）為材料,通過(guò)搖瓶發(fā)酵的方法獲得其發(fā)酵液,采用對(duì)峙培養(yǎng)法和生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定了菌體和發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌Verticillium dahliae,小麥赤霉病菌病菌Gibberella zeae,水稻紋枯病菌Thanatephorus cucumeris,蘋(píng)果炭疽病菌Glomerella cingulata,小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis,番茄灰霉病菌Botrytis cinerea,辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici等7種植物病原真菌的生物活性.結(jié)果表明：ZXK菌體及其發(fā)酵液對(duì)7種病原菌都有較好的抑制作用,ZXK發(fā)酵液能夠完全抑制蘋(píng)果炭疽病菌、水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和小麥紋枯病菌菌絲的生長(zhǎng),對(duì)棉花黃萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制率也達(dá)到了90%以上；發(fā)酵液經(jīng)離心、過(guò)濾和高壓蒸汽滅菌處理后仍具有生物活性,其中以高壓蒸汽滅菌處理的發(fā)酵液樣品的抑菌活性損失最大.

ZXK菌株；培養(yǎng)；發(fā)酵；抑菌活性

隨著化學(xué)農(nóng)藥使用量的增大及使用范圍的擴(kuò)張,特別是高毒、高殘留農(nóng)藥的持續(xù)使用,農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響日趨嚴(yán)重.社會(huì)的進(jìn)步和現(xiàn)代的發(fā)展要求開(kāi)發(fā)出新的能夠保護(hù)農(nóng)產(chǎn)品穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn),又不影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量,不影響環(huán)境和其他生物安全的農(nóng)藥產(chǎn)品.針對(duì)化學(xué)農(nóng)藥日漸顯現(xiàn)的種種弊病,農(nóng)藥研究人員發(fā)現(xiàn)從生物中尋找防治有害生物的生物農(nóng)藥最有可能達(dá)到選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對(duì)人畜無(wú)害的理想要求[1].有效地利用微生物間的拮抗作用及其代謝產(chǎn)物的有效活性成分制備生物農(nóng)藥進(jìn)行生物防治將是一個(gè)必要的發(fā)展方向.

微生物是生物殺菌劑的重要來(lái)源,微生物殺菌劑主要有農(nóng)用抗生素、細(xì)菌殺菌劑、真菌殺菌劑等類型,并且具備選擇性高、安全性好、易降解、用量少、殘留少、污染小等優(yōu)點(diǎn)[2-3].據(jù)統(tǒng)計(jì),目前國(guó)際上生物農(nóng)藥產(chǎn)品已超過(guò)100多種,但90%以上是微生物殺蟲(chóng)劑.而Philip在2002年就預(yù)測(cè)第二個(gè)重要的商業(yè)化的生物農(nóng)藥將是微生物殺菌劑[4].

在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)從傳統(tǒng)方式向綠色產(chǎn)業(yè)和出口創(chuàng)匯產(chǎn)業(yè)的過(guò)渡中,微生物農(nóng)藥具有重要的意義.由于細(xì)菌的種類多、數(shù)量大、繁殖速度快,可以通過(guò)功能基因的修飾、改造、轉(zhuǎn)移等基因工程手段構(gòu)建新型的工程菌,且易于人工培養(yǎng)和控制.因此,細(xì)菌殺菌劑的研究和開(kāi)發(fā)具有較大的前景[5-6].

本試驗(yàn)中使用的ZXK菌株為從抑菌活性測(cè)定試驗(yàn)受污染平板中分離得到,試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該菌能夠明顯抑制供試植物病原真菌的擴(kuò)展生長(zhǎng).為進(jìn)一步探索ZXK菌株的抑菌活性,對(duì)ZXK菌體及其發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行了研究,為其在農(nóng)業(yè)殺菌劑領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 ZXK菌種ZXK菌種轉(zhuǎn)接在PDA試管斜面培養(yǎng)基中,于4℃冰箱中保存.

1.1.2 供試植物病原菌選取7種植物病原真菌,分別是：棉花黃萎病菌Verticillium dahliae,小麥赤霉病菌病菌Gibberella zeae,水稻紋枯病菌Thanatephorus cucumeris,蘋(píng)果炭疽病菌Glomerella cingulata,小麥紋枯病菌Rhizoctonia cereali,番茄灰霉病菌Botrytis cinerea,辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici.所有供試菌種均由河南科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院生測(cè)室提供,菌種用PDA斜面培養(yǎng)基保存在4℃下備用.

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g,葡萄糖12 g,瓊脂粉12 g,水1 000 mL,pH自然.將馬鈴薯去皮,切成塊煮沸20 min,然后用紗布過(guò)濾,補(bǔ)足水至1 000 mL,再加葡萄糖及瓊脂,完全溶化后分裝,121℃高壓蒸汽滅菌20 min.

PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g,葡萄糖12 g,水1 000 mL,pH自然.將馬鈴薯去皮,切成塊煮沸20 min,然后用紗布過(guò)濾,補(bǔ)足水至1 000 mL,再加葡萄糖,完全溶化后三角瓶分裝,每瓶100 mL,121℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ZXK菌種的發(fā)酵菌種的發(fā)酵培養(yǎng)采用搖瓶發(fā)酵法,用接種環(huán)挑取ZXK菌種轉(zhuǎn)接于盛有100 mL PD培養(yǎng)液的三角瓶中,置于搖床中28℃培養(yǎng)36 h.

1.2.2 發(fā)酵液的處理采用離心、濾芯及高壓滅菌等3種方法對(duì)ZXK發(fā)酵液進(jìn)行處理.

離心處理：3 000 r/min離心5 min,取上清液；

濾芯處理：孔徑為0.45 μm的濾芯過(guò)濾取濾液；高壓滅菌處理：121℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.2.3 抑菌活性測(cè)定分別采用平板對(duì)峙法和生長(zhǎng)速度法測(cè)定ZXK菌種及其發(fā)酵液的抑菌活性.

平板對(duì)峙法：將細(xì)菌ZXK及7種供試病原真菌置于PDA固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)5 d,用滅菌的打孔器在各長(zhǎng)滿菌絲的平板上打制直徑為4 mm的菌餅備用.分別挑取已制好的ZXK菌餅及供試病原真菌菌餅各1塊,接于PDA平板中央兩側(cè),相距約為3 cm.將各平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5 d后開(kāi)始觀察長(zhǎng)勢(shì).

生長(zhǎng)速率法：用移液槍移取發(fā)酵液1 mL加入20 mL的刻度試管中（以加入等量無(wú)菌水作為對(duì)照）,用融化的PDA培養(yǎng)基定容至10 mL,混勻后倒入直徑為9 cm的已滅菌培養(yǎng)皿中制成帶藥平板,設(shè)置空白對(duì)照.用接種針挑取ZXK菌餅（4 mm）倒扣在平板中央,每皿放置1個(gè)菌餅,每個(gè)處理重復(fù)3次.處理好的培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)間里培養(yǎng)72 h后開(kāi)始檢查結(jié)果（水稻紋枯病菌48 h后開(kāi)始檢查結(jié)果）[7].按以下公式計(jì)算菌落生長(zhǎng)直徑及抑制率：

菌落生長(zhǎng)直徑/mm＝菌落直徑-4

抑制率/%=（（對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 ZXK菌體抑菌活性的測(cè)定

ZXK對(duì)7種供試植物病原真菌的抑菌作用結(jié)果（平板對(duì)峙法）見(jiàn)圖1.

圖1 ZXK對(duì)7種植物病原菌的對(duì)峙抑菌作用Fig.1 Dual culture of ZXK on seven phytopathogens

由圖1可知,在平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中,ZXK對(duì)7種供試植物病原真菌均表現(xiàn)出了抑菌作用,說(shuō)明ZXK菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠分泌抑菌活性物質(zhì).

2.2 ZXK發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定

發(fā)酵液對(duì)7種病原真菌的抑制作用（生長(zhǎng)速率法）見(jiàn)表1.

由表1可知,在生長(zhǎng)速率法中,ZXK發(fā)酵液對(duì)7種供試病原菌均具有很強(qiáng)的抑菌活性.其中,對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌、水稻紋枯病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌和棉花黃萎病菌等6種病原菌的抑菌活性都在90%以上,甚至能夠完全抑制蘋(píng)果炭疽病菌、水稻紋枯病菌、小麥紋枯病菌和小麥赤霉病菌菌絲的生長(zhǎng).

表1 ZXK發(fā)酵液對(duì)7種病原菌的抑菌活性Tab.1 Antifungal activities of ZXK fermentation broth on seven phytopathogens

2.3 處理方法對(duì)ZXK發(fā)酵液抑菌活性的影響

為明確ZXK發(fā)酵液抑菌活性成分的性質(zhì),進(jìn)一步選取小麥赤霉病菌病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌和辣椒疫霉病菌等4個(gè)不同亞門(mén)的病原菌作為供試對(duì)象,分別測(cè)試離心、濾芯過(guò)濾和高壓蒸汽滅菌3種處理方法對(duì)ZXK發(fā)酵液活性的影響,結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 ZXK發(fā)酵液經(jīng)不同方法處理后的抑菌活性Tab.2 Antifungal activities of ZXK fermentation broth treated with different methods%

由表2可知,經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理的發(fā)酵液對(duì)4種病原真菌的抑制率均大幅降低,其抑菌活性顯著低于離心和濾芯過(guò)濾處理的抑菌活性,說(shuō)明ZXK發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)具有熱不穩(wěn)定性.經(jīng)離心和濾芯過(guò)濾處理所得ZXK發(fā)酵液對(duì)小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌和水稻紋枯病菌的抑菌活性均有所降低,其中以對(duì)小麥紋枯病菌的抑菌活性降低較為明顯,降低到50%以下,而對(duì)水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌的抑制率仍高于90%.值得關(guān)注的是,離心和濾芯過(guò)濾處理所得ZXK發(fā)酵液對(duì)辣椒疫霉病菌的抑制率高于未處理ZXK發(fā)酵液,由49.20%升到75%以上,這可能是由于活性物質(zhì)在高溫高壓處理下轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)辣椒疫霉病菌具有特異生物活性的物質(zhì).

3 小結(jié)

本試驗(yàn)對(duì)ZXK菌及其發(fā)酵液的生物活性進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明ZXK菌體及其發(fā)酵液對(duì)供試的7種植物病原真菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性；ZXK發(fā)酵液的處理方法對(duì)其活性有顯著影響.因此,對(duì)ZXK菌株進(jìn)行鑒定,對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,獲取最佳發(fā)酵條件,對(duì)于擴(kuò)大培養(yǎng)ZXK菌具有重要意義.同時(shí),明確ZXK發(fā)酵液中抑菌活性成分的性質(zhì),采用活性追蹤的方法對(duì)發(fā)酵液中的抑菌活性成分進(jìn)行分離,進(jìn)而鑒定其結(jié)構(gòu),可以為開(kāi)發(fā)、應(yīng)用ZXK菌株,發(fā)展微生物農(nóng)用殺菌劑提供一定的理論依據(jù).

[1]沈寅初.農(nóng)用微生物殺菌劑研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè),1998,19（2）：155-160.

[2]紀(jì)明山,谷祖敏,張楊.生物農(nóng)藥研究與應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37（4）：545-550.

[3]沈寅初,張一賓.生物農(nóng)藥[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2000.

[4]Jarvis P,關(guān)愛(ài)瑩,劉長(zhǎng)令.生物農(nóng)藥的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,2002,23（3）：29-31.

[5]李勇楊,李銘剛,文孟良.微生物農(nóng)藥的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,31（2）：62-63.

[6]王春,汪琨,崔志峰.芽孢桿菌活體微生物農(nóng)藥研究現(xiàn)狀及應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2013（7）：830-834.

[7]陳年春.農(nóng)藥生物測(cè)定技術(shù)[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1991.

（責(zé)任編輯：鄧天福）

Study on antifungal activity of an active bacteria

Zhu Hongxia,Li Liangjuan,Hu Linfeng
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

An active bacteria was found in the experimental process（ZXK）.Shake flask fermentation method was applied to obtain fermentation broth.The antifungal activities of ZXK and its fermentation broth were detected against Verticilliumdahliae,Gibberella zeae,Thanatephoruscucumeris,Glomerella cingulata,Rhizoctonia cerealis,Botrytis cinerea and Phytophthora capsici by dual culture method and growth rate method separately.The results showed that the ZXK and its fermentation broth had antifungal activities against tested fungi.The ZXK fermentation broth could inhibit the growth of G.zeae,T.cucumeris,G.cingulata and R.cerealis absolutely,and the inhibition rates on V. dahliae and B.cinerea were higher than 90%.ZXK fermentation broth had antifungal activity after treated by centrifuging,filtering and autoclaves.The autoclaves treating decreased the antifungal activity of fermentation broth greatly.

ZXK bacteria；cultivate；fermentation；antifungal activity

S482.2+92

A

1008-7516（2013）06-0021-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2013.06.006

2013-09-18

大學(xué)生課外科技活動(dòng)創(chuàng)新基金（20111045）

朱紅霞（1982-）,女,山西汾陽(yáng)人,助理實(shí)驗(yàn)師.主要從事天然的殺菌劑研究.

胡林峰（1981-）,男,湖北天門(mén)人,博士,副教授.主要從事天然源殺菌活性物質(zhì)篩選及其應(yīng)用研究.