譚聰倪淑娟翁微微黃丹盛偉琪廉朋

1. 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2. 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科,復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶K-ras基因突變的比較分析

譚聰1倪淑娟1翁微微1黃丹1盛偉琪1廉朋2

1. 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2. 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科,復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：K-ras基因突變是抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)靶向治療的重要負性預測因子。本研究擬對結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中K-ras基因狀態(tài)的一致性進行比較，以探討目前臨床K-ras檢測的科學性與嚴謹性。方法：收集復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶石蠟包埋組織76對，提取DNA，經(jīng)過PCR擴增后，對產(chǎn)物進行基因序列分析，檢測結(jié)直腸癌中K-ras基因外顯子2基因序列。結(jié)果：76例患者中有15例結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因突變情況不一致。76例結(jié)直腸癌原發(fā)灶有31例發(fā)生突變，突變率為40.8%，其中第13號密碼子突變16例，第12號密碼子突變15例；76例結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶有31例發(fā)生突變，突變率為40.8%，其中第13號密碼子突變15例，第12號密碼子突變16例。結(jié)論：結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中K-ras基因狀態(tài)并不一致，且存在19.7%的表達差異率，提示通過檢測原發(fā)灶K-ras基因表達狀態(tài)來確定針對轉(zhuǎn)移灶的西妥昔單克隆抗體藥物選擇存在不嚴謹性，需要進一步完善。

結(jié)直腸癌；K-ras基因；原發(fā)灶；轉(zhuǎn)移灶；西妥昔單抗

結(jié)直腸癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居全球第3，在我國位居第4［1］。近年來，個體化治療效果顯著，如針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向藥物(西妥昔單抗和帕尼單抗)在結(jié)直腸癌的治療中取得了良好的效果，但K-ras基因突變的患者并不能從中受益［2］。K-ras是EGFR信號通路中最常發(fā)生突變的基因，該基因突變是結(jié)直腸癌最常見的相關(guān)基因改變之一。當K-ras基因呈突變狀態(tài)時RAS蛋白持續(xù)活化，即使阻斷上游EGFR也無法調(diào)控下游事件的發(fā)生，因此腫瘤細胞可持續(xù)生長、增殖甚至轉(zhuǎn)移［3］。自2008年K-ras基因檢測被寫入美國《國家綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》后，接受K-ras基因檢測的患者以前所未有的速度在全球范圍內(nèi)迅速增長。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟的過程，在腫瘤形成和發(fā)育的不同階段不但具有不同的基因突變和表達譜，而且腫瘤組織存在異克隆生長的現(xiàn)象，因此轉(zhuǎn)移病灶和原發(fā)病灶之間可能具有不同的生物學特性和特異性基因表達特點［4-6］。目前K-ras檢測中大部分患者是提供原發(fā)灶的樣本，在醫(yī)療中心或者基因公司進行檢測，而西妥昔單抗和帕尼單抗治療的位點是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移病灶，這就不可避免地存在著治療靶點-轉(zhuǎn)移病灶(特別是異時性轉(zhuǎn)移患者)與檢測位點-原發(fā)病灶偏移的臨床現(xiàn)實。K-ras基因突變在兩個位點的表達一致性具有較大的臨床價值，對于提供藥物選擇的依據(jù)至關(guān)重要。因此本研究運用PCR與直接測序法對76對結(jié)直腸癌及其轉(zhuǎn)移灶進行K-ras基因突變的檢測，探討在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中K-ras基因突變的一致性，為臨床用藥選擇的基本流程提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2004—2012年在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院就診并符合下述條件的76例患者(其中61例患者初診時同時發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，15例異時遠處轉(zhuǎn)移)的患者資料。入選標準：①病理組織學確診為結(jié)直腸癌；②患者的性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及TNM分期等臨床病理資料完整。本研究通過復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準。

1.2 DNA提取

根據(jù)HE切片，從石蠟包埋組織切片上刮取富含腫瘤組織的區(qū)域，按照試劑(Qiagen DNA mini kit)說明提取石蠟包埋組織中的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 K-ras基因突變檢測

采用下述引物聚合酶鏈反應擴增K-ras基因外顯子2，上游引物：5’-AGGCCT GCTGAAAATGACTG-3’，下游引物：5’-TCAAAGAATGGTCCTGCA CC-3’，目的片段173 bp，反應條件為：初始變性94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確定后，將陽性PCR產(chǎn)物用DNA片段純化試劑盒純化(AXYGEN Bioseiences)，用ABI公司的3730XL測序儀進行序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 患者基本資料

76例結(jié)直腸癌患者中，男性44例(57.9%)，女性32例(42.1%)，中位年齡54.8歲(27～81歲)；左半結(jié)腸癌18例(23.7%)，右半結(jié)腸癌24例(31.6%)，直腸癌34例(44.7%)；初診伴發(fā)遠處轉(zhuǎn)移61例，術(shù)后發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移15例；肝轉(zhuǎn)移59例，肺轉(zhuǎn)移2例，卵巢轉(zhuǎn)移15例。

2.2 結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中K-ras基因突變情況

腫瘤標本K-ras基因外顯子2序列檢測結(jié)果顯示，76例結(jié)直腸癌原發(fā)灶有31例發(fā)生突變，突變率為40.8%，其中第13號密碼子突變16例，12號密碼子突變15例；76例轉(zhuǎn)移灶標本同樣有31例發(fā)生突變，突變率為40.8%，其中第13號密碼子突變15例，第12號密碼子突變16例。基因測序結(jié)果顯示，76例K-ras突變均為點突變(圖1)，包括2號外顯子的第12和13位密碼子突變，第12位密碼子突變均為GGT＞GAT(G12D)突變，而第13位突變均為GGC＞GAC(G13D)突變。然而76例患者中，15例結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的突變情況不一致，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的突變不一致率達19.7%(15/76)：8例原發(fā)灶為K-ras突變型(6例為G13D，2例為G12D)，而轉(zhuǎn)移灶K-ras為野生型；7例原發(fā)灶為野生型，而轉(zhuǎn)移灶為突變型(5例為G13D，2例為G12D，表1)。

圖 1 K-ras基因2號外顯子第12和13位密碼子的點突變Fig. 1 G12D and G13D mutation of K-ras exon 2

表 1 K-ras基因突變患者分子及臨床特征Tab. 1 Molecular and clinical characteristics of patients with CRC harboring K-RAS mutations

3 討 論

伊立替康或奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶是目前治療復發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的主要化療方案，可延長患者的生存期，但是中位生存期仍不足2年［7］。研究顯示，針對EGFR的靶向治療藥物西妥昔單抗及帕尼單抗聯(lián)合化療一線治療K-ras野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的有效率達57%～61%，而對K-ras突變患者的有效率僅為0～6%［8］。提示K-ras基因狀態(tài)的檢測對西妥昔單抗等抗EGFR單克隆抗體靶向治療的療效具有重要的預測意義。

K-ras基因是Ras癌基因家族中的一員，其突變是結(jié)直腸癌形成過程最重要的基因改變之一。目前，國內(nèi)外研究報道的結(jié)直腸癌患者中K-ras基因突變率及類型不盡相同，這可能與樣本量大小、不同的檢測方法及人種差異有關(guān)［9-12］。本研究運用直接測序法在76例結(jié)直腸癌患者中檢測K-ras基因突變，結(jié)果原發(fā)灶中突變患者31例(40.8%)，與部分西方國家及亞洲人群的研究結(jié)果類似［13-14］，且突變與性別、年齡及腫瘤部位無關(guān)(P＞0.05)。研究中K-ras突變的類型包括第12位密碼子的GGT ＞ GAT突變與第13密碼子的GGC＞GAC突變，兩者的突變率相似。然而在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶K-ras基因突變情況不一致的15例患者中，11例為13密碼子的突變(其中6例為原發(fā)灶突變型，轉(zhuǎn)移灶野生型；5例為原發(fā)灶野生型，轉(zhuǎn)移灶突變型)，僅4例為12密碼子的突變(2例為原發(fā)灶突變型，轉(zhuǎn)移灶野生型；2例為原發(fā)灶野生型，轉(zhuǎn)移灶突變型)，提示原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶K-ras基因狀態(tài)不一致較常發(fā)生在13密碼子，有研究顯示，該密碼子的突變預示著腫瘤的高轉(zhuǎn)移潛能，而第12密碼子的GAT突變則與結(jié)直腸癌預后差相關(guān)［15-16］。

目前有研究認為，mCRC原發(fā)灶或非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶均可作為K-ras突變檢測的靶標組織，僅轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)不適宜進行K-ras檢測［17-19］。而本研究結(jié)果顯示，約19.7%(15/76)的患者其原發(fā)灶和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間存在K-ras基因表型的不同，包括野生型和突變型的差異以及突變位點和形式的差異。其中7例患者原發(fā)灶為野生型，轉(zhuǎn)移灶為突變型，提示該類患者如果根據(jù)常規(guī)檢測結(jié)果，選擇西妥昔單克隆抗體治療，則轉(zhuǎn)移灶的療效較差，屬于用藥指征錯誤，過度用藥。另外，8例患者原發(fā)灶為K-ras突變型，而轉(zhuǎn)移灶為野生型，根據(jù)目前用藥標準，這部分患者不推薦接受西妥昔單克隆抗體治療，從而失去獲益機會。若對原發(fā)灶為突變型的患者進一步進行轉(zhuǎn)移灶檢測(如肝臟穿刺獲取轉(zhuǎn)移灶組織)，則可增加10.5%獲益人群。這部分人群值得臨床醫(yī)師去關(guān)注和改進。

綜上所述，結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中K-ras基因狀態(tài)存在表達的不一致性。按照目前臨床常規(guī)診療的流程，因為檢測位點和治療位點的偏移，會導致患者在用藥選擇方面缺乏科學性和嚴謹性。這一結(jié)果提示需要對目前診療流程進行更加科學的分析和優(yōu)化，以便患者獲得最大的收益。

［1］ FERLAY J, SHIN H R, BRAY F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008［J］. Int J Cancer, 2010, 127(12): 2893-2917.

［2］ KARAPETIS C S, KHAMBATA-FORD S, JONKER D J, et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer［J］. N Engl J Med, 2008, 359(17): 1757-1765.

［3］ COLICELLI J. Human RAS superfamily proteins and related GTPases［J］. Sci STKE, 2004, (250): 13.

［4］ SHIMIZU K, YUKAWA T, HIRAMI Y, et al. Heterogeneity of the EGFR mutation status between the primary tumor and metastatic lymph node and the sensitivity to EGFR tyrosine kinase inhibitor in non-small cell lung cancer［J］. Target Oncol, 2012. ［Epub ahead of print］.

［5］ PEREZ K, WALSH R, BRILLIANT K, et al. Heterogeneity of colorectal cancer (CRC) in reference to KRAS proto-oncogene utilizing WAVE technology［J］. Exp Mol Pathol, 2013, 95(1): 74-82.

［6］ JULIEN S, MERINO-TRIGO A, LACROIX L, et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer［J］. Clin Cancer Res, 2012, 18(19): 5314-5328.

［7］ MEYERHARDT J A, MAYER R J. Systemic therapy for colorectal cancer［J］. N Engl J Med, 2005, 352(5): 476-487.

［8］ SOBRERO A F, MAUREL J, FEHRENBACHER L, et al. EPIC: phase III trial of cetuximab plus irinotecan after fluoropyrimidine and oxaliplatin failure in patients with metastatic colorectal cancer［J］. J Clin Oncol, 2008, 26(14): 2311-2319.

［9］ KIM M J, LEE H S, KIM J H, et al. Different metastatic pattern according to the KRAS mutational status and sitespecific discordance of KRAS status in patients with colorectal cancer［J］. BMC Cancer, 2012, 12: 347.

［10］ FRANKLIN W A, HANEY J, SUGITA M, et al. KRAS mutation: comparison of testing methods and tissue sampling techniques in colon cancer［J］. J Mol Diagn, 2010, 12(1): 43-50.

［11］ NORMANNO N, PINTO C, CASTIGLIONE F, et al. KRAS mutations testing in colorectal carcinoma patients in Italy: from guidelines to external quality assessment［J］. PLoS One, 2011, 6(12): 29146.

［12］ MALAPELLE U, BELLEVICINE C, SALATIELLO M, et al. Sanger sequencing in routine KRAS testing: a review of 1720 cases from a pathologist’s perspective［J］. J Clin Pathol, 2012, 65(10): 940-944.

［13］ VAN CUTSEM E, KOHNE C H, HITRE E, et al. Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer［J］. N Engl J Med, 2009, 360(14): 1408-1417.

［14］ 高靜, 孫志偉, 李艷艷, 等. 中國結(jié)直腸癌患者966例中KRAS和BRAF基因突變分析［J］. 中華病理學雜志, 2012, 9(41): 579-583.

［15］ IMAMURA Y, MORIKAWA T, LIAO X, et al. Specific mutations in KRAS codons 12 and 13, and patient prognosis in 1075 BRAF wild-type colorectal cancers［J］. Clin Cancer Res, 2012, 18(17): 4753-4763.

［16］ BAZAN V, MIGLIAVACCA M, ZANNA I, et al. Specific codon 13 K-ras mutations are predictive of clinical outcome in colorectal cancer patients, whereas codon 12 K-ras mutations are associated with mucinous histotype［J］. Ann Oncol, 2002, 13(9): 1438-1446.

［17］ MOLINARI F, MARTIN V, BORDONI A, et al. Analysis of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene status and protein expression, and K-ras gene mutations in metastatic colorectal cancer patients: Comparison between primary tumor and related metastatic sites［J］. Ann Oncol, 2008, 19(suppl 1): 10-25.

［18］ SANTINI D, LOUPAKIS F, VINCENZI B, et al. High concordance of KRAS status between primary colorectal tumors and related metastatic sites: implications for clinical practice［J］. Oncologist, 2008, 13(12): 1270-1275.

［19］ VELHO S, OLIVEIRA C, SERUCA R. KRAS mutations and anti-epidermal growth factor receptor therapy in colorectal cancer with lymph node metastases［J］. J Clin Oncol, 2009, 27(1): 158-159.

Evaluation of K-ras status concordance between primary colorectal cancer and related metastatic sites

TAN Cong1, NI Shu-juan1, WENG Wei-wei1, HUANG Dan1, SHENG Wei-qi1, LIAN Peng2(1. Department of Pathology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Department of Colorectal Cancer Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

LIAN Peng E-mail: lianpeng77@sohu.com

Background and purpose: Metastatic colorectal cancer (mCRC) patients with K-ras mutation won’t benefit in the anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) treatments. Thus K-ras mutation analysis is mandatory before this treatment. There is controversy that K-ras mutation analysis should be performed on primaries or related metastases. The aim of our study was to evaluate the concordance of K-ras status between primary and related metastases tumors, thus investigate the validity and rigorousness of clinical K-ras testing. Methods: Seventy-six patients with confirmed mCRC treated in Fudan University Shanghai Cancer Center were enrolled. After DNA extraction and PCR amplification, tumor specimens with paired primary tumors and related metastatic sites were put into sequencing analysis. And the K-ras mutation status in exon 2 was assessed. Results: K-ras mutation was detected in 31 out of 76 primary tumours (40.8%) and also 40.8% of the metastatic sites. But discordance was found between primary tumor and metastasis in 15 cases (19.7%): 8 primary tumors had a K-ras mutation with a wildtype metastasis, meanwhile 7 primary tumors were wild type with a K-ras-mutated metastasis. Conclusion: Our study indicated that quite a few mCRC cases have different K-ras status between primary tumors and related metastatic sites, and it’s not very rigorous to choose the anti-EGFR treatments merely according to the primary tumor-K-ras mutation.Further study and consultation are needed on this problem.

Colorectal cancer; K-ras gene; Primary tumor; Metastases; Cetuximab

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.008

R735.3

：A

：1007-3639(2013)10-0829-05

2013-06-14

2013-09-10）

上海市衛(wèi)生局青年科研項目(No:2008Y079)。

廉朋 E-mail:lianpeng77@sohu.com