家蠅3齡幼蟲石蠟切片的組織學研究

胡 蓉，張 姝，吳建偉，國 果，付 萍

(貴陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴陽 550004)

石蠟切片技術(shù)是組織學研究最基本的實驗方法。昆蟲消化系統(tǒng)石蠟切片的組織學研究報道較多，如韭菜遲眼蕈蚊幼蟲(Song et al.，2004)、興義維蚋成熟幼蟲(Xun et al.，2011)、黃臉油葫蘆(Lu et al.，2009)等。但昆蟲堅硬的外殼(皮)和開放的循環(huán)系統(tǒng)等卻制約了整蟲組織的石蠟切片制作，昆蟲整蟲石蠟切片的組織學研究報道較少，具有代表性的是改良的石蠟切片法研究致倦庫蚊組織結(jié)構(gòu)(Yan et al.，2011)。家蠅Musca domestica 是分布廣泛的環(huán)境昆蟲(Su ZJ et al.，2010)，其組織器官的結(jié)構(gòu)及功能分子的定位一直備受關(guān)注，國內(nèi)的研究主要有:3齡幼蟲血細胞體外熒光染色(Liu et al.，2008)、雌家蠅產(chǎn)卵器和足上感受器的掃描電鏡觀察(Wang and Mo，2010)，利用冰凍切片定位抗菌肽基因(Yang et al.，2012)等;國外的主要研究是通過電鏡觀察蛹(Siriwattanarungsee et al.，2005)、1齡幼蟲(Szpila and Pape，2008)、馬氏管(Sohal，1974)和唾液腺(Lietze et al.，2011)的超微結(jié)構(gòu)，在定位基因表達部位時涉及到成蟲頭部石蠟切片(Codd et al.，2007)以及幼蟲和成蟲中樞神經(jīng)系的組織切片(Sha et al.，2012)。關(guān)于家蠅整蟲石蠟切片的組織學研究尚未見報道。本研究以家蠅3齡幼蟲為研究對象，探索合適的石蠟切片制作方法，并通過蘇木精－伊紅(hematoxylin－eosin，HE)染色、過碘酸－希夫氏(periodic acid－schiff，PAS)染色顯示家蠅幼蟲的組織結(jié)構(gòu)以及多糖和糖蛋白的分布，為家蠅3齡幼蟲的組織學研究提供系統(tǒng)的形態(tài)學資料，并為進一步定位家蠅的功能分子提供可靠的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗昆蟲

家蠅幼蟲為貴陽醫(yī)學院寄生蟲學教研室馴化飼養(yǎng)多代的室內(nèi)種群。

1.1.2 主要試劑及儀器

多聚甲醛(Sigma)，蘇木精(Sigma)，伊紅(Sigma)，石蠟、過碘酸、堿性品紅等為國產(chǎn)分析純，A0821S 回轉(zhuǎn)式切片機(AO)，載玻片烘干機(Leica)，DME 321058943PX 顯微鏡帶一體化攝像頭(Leica)。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制備

按照杜卓明主編《實用組織學技術(shù)》配制相關(guān)試劑并制作家蠅3齡幼蟲組織切片(Du ZhM，1988)，固定劑用Carnoy 液或含0.25% TritonX－100的4% 多聚甲醛液(Yan et al.，2011)，切片厚4～6 μm。

1.2.2 組織學染色

1.2.2.1 HE 染色

二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min，純乙醇Ⅰ、純乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、70%乙醇各3 min，自來水洗擦干，蘇木精染色10 min，自來水沖洗，酸酒精分色20 s，自來水沖洗，氨酒精藍化3 min，自來水沖洗，伊紅染色10 min，自來水沖洗，95% 乙醇分色，37℃烤片2 h，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2.2 PAS 染色

石蠟切片按1.2.2.1 的方法化蠟入水擦干后，過碘酸5 min，超純水洗兩遍，schiff 試劑(避光)30 min，超純水洗兩遍，部分切片經(jīng)蘇木精復染，超純水洗，37℃烤片2 h，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與討論

在多聚甲醛固定液中加入0.25% TritonX－100(Yan et al.，2011)或用Carnoy 固定液都適合于家蠅3齡幼蟲的固定，而且固定后切除部分表皮，使脫水和浸蠟等過程能夠順利完成，才能得到組織結(jié)構(gòu)完整、清晰的家蠅3齡幼蟲石蠟切片。冠狀面HE 染色顯示，家蠅3齡幼蟲體節(jié)明顯，組織結(jié)構(gòu)主要包括消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、血細胞、呼吸系統(tǒng)、表皮、肌肉和脂肪體等(圖1)。表皮、肌肉以及脂肪體是家蠅3齡幼蟲體壁的主要組成成分，較多成群分布的脂肪體細胞與其它器官一起分布于體腔中，血淋巴呈染成均質(zhì)的粉色。消化系統(tǒng)由腸道和唾液腺組成。腸道為縱貫體腔中央的長管狀結(jié)構(gòu)，從頭節(jié)口腔開始，止于腹節(jié)末端的肛門處，分為前腸、中腸和后腸三部分。切片顯示前腸由咽部、嗉囊、食道、前胃和胃盲囊組成，主要位于胸節(jié)，而中腸是腸道中最長的器官，故在腹節(jié)可見多個中腸切面，腹節(jié)末端可見后腸切面。唾液腺位于胸節(jié)，可延伸到第1～2 腹節(jié)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)位于胸節(jié)，可見對稱分布的腦組織。排泄系統(tǒng)主要是馬氏管，位于中腸和后腸周圍的體腔內(nèi)。血細胞大多集聚在3齡幼蟲尾部。呼吸系統(tǒng)主要由氣管及其分支構(gòu)成，開口于前后氣門。

圖1 家蠅3齡幼蟲冠狀面HE 染色全視圖Fig.1 General view of coronal plane of the third instar of Musca domestica with HE staining

2.1 腸道

家蠅3齡幼蟲的前腸包括咽部、嗉囊、食道、前胃和胃盲囊。咽部后方通過薄層扁平上皮與嗉囊相連接(圖2A)。嗉囊壁厚，可分為4～5 層(圖2B)，外膜為一層單層扁平上皮，胞質(zhì)強嗜堿性;內(nèi)有一層彈性膜，呈均質(zhì)嗜酸性的波浪狀;彈性膜內(nèi)為較厚的結(jié)締組織;PAS 染色顯示彈性膜與結(jié)締組織之間有一層梭形細胞，含豐富的糖原顆粒;內(nèi)層為單層立方或柱狀上皮，胞質(zhì)嗜堿性。嗉囊末端與食道相連(圖2C)，食道管壁主要由單層扁平上皮和平滑肌層構(gòu)成。食道末端內(nèi)陷入前胃，構(gòu)成一個特殊套管樣結(jié)構(gòu)(圖2D)，內(nèi)襯食道上皮和肌層，外被高錐形上皮;外表面是一層強嗜堿性上皮。前胃與中腸交匯處發(fā)出2 對細長的胃盲囊(圖2E)，胃盲囊上皮由單層細胞構(gòu)成，上皮起始部的細胞呈錐形，逐漸移行為立方形至矮柱狀。

中腸的不同部位，上皮的形態(tài)各異。中腸起始部的上皮為單層高圓錐形(圖2D，F(xiàn))，細胞核卵圓形居中，核染色質(zhì)疏松;PAS 染色中腸上皮腔面見紫紅色、整齊排列的紋狀緣(圖2F)。遠離起始部的上皮細胞逐漸變?yōu)榘珗A錐形，甚至移行為單層扁平上皮，腸腔內(nèi)容物被圍食膜包裹(圖2G)。圍食膜為弱嗜堿性的薄膜狀結(jié)構(gòu)，與腸壁細胞間有一空隙，內(nèi)含上皮細胞生命活動的各種產(chǎn)物。

后腸可分為3個部分，幽門、回腸和直腸。幽門位于后腸與中腸交界處，即馬氏管匯入處，上皮向腸腔內(nèi)褶形成嵴(圖2H)，腸壁細胞結(jié)構(gòu)模糊，可見卵圓形的細胞核，肌層較發(fā)達。回腸組織結(jié)構(gòu)與幽門相似(圖2I)。直腸腸腔較窄，上皮無嵴狀突起，上皮細胞為立方形(圖2J)。

家蠅3齡幼蟲嗉囊和前胃的結(jié)構(gòu)是前腸中較特異的部分。石蠟切片HE 染色和PAS 染色顯示，嗉囊壁厚，又有彈性膜，說明嗉囊可以調(diào)節(jié)囊內(nèi)容物的容量，切片顯示的是空虛時的嗉囊壁厚腔小;其前端肌肉組織豐富，可能有防止食物反流至咽部的作用。前胃中央食道內(nèi)陷形成套管樣結(jié)構(gòu)、中腸不同區(qū)域上皮的組織結(jié)構(gòu)明顯不同、以及后腸分為幽門、回腸和直腸等研究結(jié)果與興義維蚋Wilhelmia xingyiense Chen and Zhang 成熟幼蟲消化道的結(jié)構(gòu)(Xun et al.，2011)相似。而回腸與胃盲囊的結(jié)構(gòu)與韭菜遲眼蕈蚊 Bradysia odoriphaga 幼蟲的組織學研究(Song et al.，2004)基本一致。家蠅3齡幼蟲中腸可見圍食膜，這為中腸上皮細胞免受食物顆粒的機械性損傷和以食物為載體的病原體的入侵提供了結(jié)構(gòu)基礎(Zhang et al.，2009)。

2.2 唾液腺

圖2 家蠅3齡幼蟲石蠟切片F(xiàn)ig.2 Paraffin tissue sections of the third instar of Musca domestica

家蠅3齡幼蟲有一對單管泡狀的唾液腺(圖2K)，對稱分布于前腸及神經(jīng)組織的兩側(cè)。分泌部細胞近導管端為梭形，遠離導管端為圓錐形，上皮細胞的形態(tài)特點與研究人員(Lietze，et al.，2011)在透射電鏡下觀察到的細胞形態(tài)相符合。而且還可清楚地辨別兩種嗜色性不同的細胞(圖2L)，嗜酸性細胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量紫紅色的酶原顆粒，嗜堿性細胞胞質(zhì)內(nèi)充滿嗜堿性顆粒，這為研究唾液腺的分泌細胞和非分泌細胞提供了形態(tài)學基礎。

2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)

家蠅3齡幼蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的構(gòu)成與果蠅(Gong and Liu，2011)的相似，也為腦－腹神經(jīng)索復合體(Sha et al.，2012)，主要由腦和腹神經(jīng)索組成(圖2M)。腹神經(jīng)索周邊神經(jīng)元較多(圖2N)，細胞核大而圓，核染色淺，核仁明顯(圖2O)，中央主要是神經(jīng)元突起所在的部位，染成粉紅色。

2.4 馬氏管

家蠅3齡幼蟲有2 條細長的馬氏管，末斷游離于消化道周圍，近端匯入中腸與后腸分界處(圖2H)，馬氏管上皮由單層細胞圍成(圖2P)，細胞核大，卵圓形，凸向腔面，細胞質(zhì)豐富，PAS 染色上皮游離面紋狀緣明顯(圖2Q)，這些組織結(jié)構(gòu)與學者們對家蠅馬氏管的電鏡研究相符合(Sohal，1974)，為證明馬氏管上皮也具有吸收功能提供了形態(tài)學依據(jù)。

2.5 血細胞

HE 染色的石蠟切片中家蠅3齡幼蟲的血細胞的形態(tài)清楚，分為原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞以及類絳血胞5類(圖2R)。原血胞較小，呈圓形，細胞核大而圓，胞質(zhì)很少。漿血胞大小不一，圓形或卵圓形，細胞核圓形，核染色質(zhì)致密，沿核的中心向四周呈輻射狀分布，形似車輪狀，這是漿血胞s 的典型特征，胞質(zhì)豐富，強嗜堿性。粒血胞圓形或卵圓形，細胞核染色淺，輪廓不清楚，胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的嗜堿性顆粒，顆?？筛采w在細胞核上。珠血胞體積較大，細胞核圓形或卵圓形，染色淺，核仁明顯，細胞質(zhì)內(nèi)含大量嗜堿性顆粒，顆粒大小一致，分布均勻。類絳血胞體積最大，且大小不一，多為圓形，核圓居中，胞質(zhì)充滿粗大的嗜酸性顆粒，顆粒折光性強，較大的類絳血胞細胞壁容易破裂。家蠅幼蟲血細胞HE 染色的特點與體外熒光染色(Liu et al.，2008)的形態(tài)特征互為補充。

2.6 氣管及其分支

家蠅3齡幼蟲的呼吸系統(tǒng)由氣管及分支形成的支氣管樹構(gòu)成，終端開口于前、后氣門。各級氣管分支的組織結(jié)構(gòu)與氣管相同，只是管腔逐漸變小，管壁逐漸變薄。氣管上皮為單層扁平上皮(圖2S)，與電鏡下微氣管(Lietze et al.，2011)的結(jié)構(gòu)相似，胞質(zhì)較少，強嗜堿性，細胞核卵圓形，上皮腔面有一層嗜酸性均質(zhì)狀的內(nèi)膜，形如柵欄狀。

2.7 表皮、肌組織及脂肪體

表皮由淺表的幾丁質(zhì)層和深部的表皮細胞構(gòu)成(圖2S)。幾丁質(zhì)層厚，呈嗜酸性，且越接近體表嗜酸性越強;表皮細胞為單層錐形，胞質(zhì)強嗜堿性。表皮內(nèi)側(cè)有較多骨骼肌，可見明顯的橫紋(圖2T)，體腔內(nèi)有大量脂肪體，由多邊形的多泡脂肪細胞構(gòu)成，其組織結(jié)構(gòu)與致倦庫蚊(Yan et al.，2011)的相似。。PAS 染色顯示，表皮細胞、骨骼肌纖維和脂肪體細胞的胞質(zhì)內(nèi)均可見染成紫紅色的糖原顆粒(圖2A，T)。糖原是動物和細菌內(nèi)糖的貯存形式，還含有多糖合成和代謝的酶等，多以顆粒形式貯存于肝和肌肉的細胞質(zhì)中。昆蟲的脂肪體相當于其它動物的肝臟。家蠅的肌組織、脂肪體和表皮細胞貯存的糖原為家蠅在復雜條件下的生命活動提供了能量儲備。

本研究為家蠅3齡幼蟲石蠟切片的制作方法提供了參考，并獲得了家蠅3齡幼蟲較系統(tǒng)和全面的組織學資料。這些研究結(jié)果為蠅類的分類和防治提供了形態(tài)學資料，也為進一步應用原位雜交和免疫組織化學技術(shù)研究家蠅功能分子(Zhang et al.，2013)的表達提供了可靠的實驗基礎。

References)

Codd V，Dolezel D，Stehlik J，Piccin A，Garner KJ，Racey SN，Straatman KR，Louis EJ，Costa R，Sauman I，Kyriacou CP，Rosato E，2007.Circadian rhythm gene regulation in the housefly Musca domestica.Genetics，177(3):1539－1551.

Du ZhM，1988.Practical Histology Technique(2ed edition).Beijing:People's Medical Publishing House.8－58.［杜卓明，1998.實用組織學技術(shù)(第二版).北京:人民衛(wèi)生出版社.8－58］

Gong ZF，Liu L，2011.The visual system of Drosophila larva.Acta Biophysica Sinica，27(7):588－595.［龔哲峰，劉力，2011.果蠅幼蟲的視覺系統(tǒng).生物物理學報，27(7):588－595］

Lu X，He H，Xi GS，2009.The microstructure of alimentary canal and Malpighian tubules of Teleogyllus emma.Chinese Bulletin of Entomology，46(5):764－768.［盧曉，何慧，奚耕思，2009.黃臉油葫蘆消化道和馬氏管的組織學觀察.昆蟲知識，46(5):764－768］

Liu H，Yan R，He LF，Wan QH，2008.Observation on hemocytes morphology of the Musca domestica larva stained by fluorescent staining methods.Chin.J.Vector.Bio.＆ Control，19(2):111－113.［劉暉，晏容，賀莉芳，萬啟惠，2008.家蠅幼蟲血細胞熒光染色法的形態(tài)觀察.中國媒介生物學及控制雜志，19(2):111－113］

Lietze VU，Salem TZ，Prompiboon P，Bouciasa DG，2011.Tissue tropism of the Musca domestica salivary gland hypertrophy virus.Virus Res.，155(1):20－27.

Sha K，Conner WC，Choi DY，Park JH，2012.Characterization，expression，and evolutionary aspects of Corazonin neuropeptide and its receptor from the house fly，Musca domestica(Diptera:Muscidae).Gene，497(2):191－199.

Szpila K，Pape T，2008.Morphology of the first instar of the house fly Musca domestica(Diptera:Muscidae).J.Med.Entomol.，45(4):594－599.

Siriwattanarungsee S，Sukontason KL，Kuntalue B，Piangjai S，Olson JK，Sukontason K，2005.Morphology of the puparia of the housefly，Musca domestica(Diptera:Muscidae) and blowfly，Chrysomya megacephala(Diptera: Calliphoridae).Parasitol.Res.，96(3):166－170.

Sohal RS，1974.Fine structure of the Malpighian tubules in the housefly，Musca domestica.Tissue and Cell，6(4):719－728.

Song J，Zheng FQ，Li ZH，Cheng JA，Luo WC，2004.Anatomy and histology of digestive system of Bradysia odoriphaga larva.Entomological Journal of East China，13(1):42－47.［宋建，鄭方強，李照會，程家安，羅萬春，2004.韭菜遲眼蕈蚊幼蟲消化系統(tǒng)的解剖學和組織學.華東昆蟲學報，13(1):42－47］

Su ZJ，Pang Y，Li GH，Zhang MJ，Lin JC，Huang YD，2010.Effects of different bacteria isolated from wheat bran on the development of housefly(Musca domestica L.)larvae.Journal of Environmental Entomology，32(1):25－35.［蘇志堅，龐義，李廣宏，張敏靜，林健聰，黃亞東，2010.麥麩飼料中細菌對家蠅幼蟲生長發(fā)育的影響.環(huán)境昆蟲學報，32(1):25－35］

Wang ZY，Mo JC，2010.Morphological study of the sensilla on ovipositors and legs of female houseflies.Chin.J.Vector.Bio.＆ Control，21(2):115－120.［王爭艷，莫建初，2010.雌家蠅產(chǎn)卵器和足上感受器的形態(tài)學研究.中國媒介生物學及控制雜志，21(2):115－120］

Xun H，Yang M，Wu H，Chen HB，2011.Histology of the alimentary canal in mature larva of Simulium(Wilhelmia)xingyiense Chen and Zhang(Diptera:Simuliidae).Chin.J.Parasitol.Parasit.Dis.Apr.，(29)2 :104－106.［尋慧，楊明，吳慧，陳漢彬，2011.興義維蚋成熟幼蟲消化道組織學研究.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，29(2):104－106］

Yang XR，Jing XB，Zhu JY，2012.The tissue expression study of musca domestica diptericin.Immunological Journal，28(8):679－683.［楊小蓉，金小寶，朱家勇，2012.家蠅抗菌肽diptericin 基因的組織表達研究.免疫學雜志，28(8):679－683］

Yan LZ，Qiao CL，Zhang JZ，Ma EB，Cui F，2011.Histological observation of major structures of the mosquito Culex pipiens quinquefasciatus(Diptera: Culicidae) using paraffin tissue section.Acta Entomologica Sinica，54(3):373－380.［閆亮珍，喬傳令，張建珍，馬恩波，崔峰，2011.致倦庫蚊主要組織結(jié)構(gòu)的石蠟切片觀察.昆蟲學報，54(3):373－380］

Zhang S，Hu R，Wu JW，Guo G，F(xiàn)u P，2013.Analysis on the components and enzymatic activity of cellulase in digestive organs from Musca domestica larvae.Journal of Environmental Entomology，35(1):55－60.［張姝，胡蓉，吳建偉，國果，付萍，2013.家蠅幼蟲消化器官中纖維素酶的組成及酶活性分析.環(huán)境昆蟲學報，35(1):55－60］

Zhang XX，Qiao GH，Liang ZP，Xu F，Cao SM，Chen XH，2009.Research progress in insect peritrophicmembrane proteins.Acta Entomologica Sinica，52(12):1366－1372.［張小霞，喬冠華，梁振普，許鋒，曹素梅，陳曉慧，2009.昆蟲中腸圍食膜蛋白研究進展.昆蟲學報，52(12):1366－1372］