霍 毅，李名漢澤，尹彬彬，邵國杰，侯毅鞠 (吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

大蒜素為大蒜鱗莖中的一種含硫化合物，具有抗菌消炎、提高機體免疫力等多種藥理作用，目前作為抗菌藥物而廣泛應(yīng)用到臨床。近年來大蒜素在抗腫瘤方面的作用也逐漸引起人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對胃癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤產(chǎn)生預(yù)防或治療作用［1］。普通抗癌藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也殺傷正常細胞，理想的抗癌藥物是最大限度的殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞的毒性較小。大蒜素是一種天然的抗癌藥物，能殺傷腫瘤細胞而對正常細胞毒性?。?］。大蒜素既可以單獨使用，也可以和放療、化療等治療方法聯(lián)合使用［3］。本試驗旨在探討大蒜素對K562細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的影響，為其在臨床應(yīng)用于白血病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

大蒜素注射液(購自安徽華源醫(yī)藥有限公司);K562細胞為吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院細胞室凍存細胞;RPMI-1640培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司);超級新生牛血清(購自杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

K562細胞于含10%超級新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中生長，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于試驗。

1.3 細胞生長狀態(tài)的觀察

常規(guī)培養(yǎng)K562細胞至對數(shù)生長期，將對數(shù)生長期細胞分成5組，以每孔104接種于96孔板中，12 h后分別加入大蒜素，使終濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，并設(shè)置對照組，培養(yǎng)48 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)并照相。

1.4 瑞氏染色觀察

常規(guī)培養(yǎng)K562細胞至對數(shù)生長期，將對數(shù)生長期細胞分成5組，12 h后分別加入大蒜素使終濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，并設(shè)置對照組，培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，離心800 r/min，5 min，棄上清，將細胞沉淀涂布于載玻片上，丙酮固定10 min后取出，PBS沖洗，自然晾干，滴加瑞氏染液1 min后再加入等量的PBS，混勻，靜置5 min后，水洗，吸干，鏡檢觀察并照相。

1.5 MTT法檢測

取對數(shù)生長期K562細胞制成細胞懸液，濃度為105/mL，接種于96孔板內(nèi)，每孔100μL，加入不同濃度的大蒜素使終濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，每一濃度均設(shè)4個復(fù)孔，并設(shè)置對照孔及調(diào)零孔，分別在加藥24 h、48h、72h后加入MTT溶液10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，離心1 000 r/min，5 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100μL Formazan溶解液，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長下測各孔吸光度，按下列公式計算抑制率，IR%=(1-試驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對K562細胞生長狀態(tài)的影響

對照組細胞體積大，多呈圓形，常聚集成團如葡萄串樣，胞漿內(nèi)未見顆粒。試驗組隨著大蒜素濃度的逐漸升高，細胞減少，部分細胞胞膜破裂，凋亡的K562細胞逐漸增多且明顯。部分細胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變:細胞分散，體積縮小，但細胞膜完整并可見凋亡小體和細胞碎屑。隨著作用時間的延長，高濃度大蒜素組(40μg/mL)主要表現(xiàn)為細胞壞死，見圖1。

圖1 K562細胞生長狀態(tài)(40×)

2.2 瑞氏染色觀察

瑞氏染色后，對照組K562細胞核圓形或橢圓形，核漿比例大。經(jīng)大蒜素作用后的K562細胞出現(xiàn)退行性變，細胞體積變小，胞質(zhì)濃染，結(jié)構(gòu)模糊，邊緣不清晰，核漿比例減小，核固縮、深染，核膜消失，細胞核斷裂成小塊或碎片狀，并且可觀察到細胞中出現(xiàn)空泡和凋亡小體，見圖2。

2.3 大蒜素對K562細胞的生長抑制作用

MTT法結(jié)果表明，K562細胞的增殖抑制率與大蒜素作用的濃度與時間有明顯依賴關(guān)系，即隨著大蒜素濃度的逐漸升高和作用時間的逐漸延長，K562細胞的生長受到明顯抑制，見圖3。

圖2 K562細胞瑞氏染色結(jié)果(100×)

圖3 不同濃度的大蒜素對K562細胞的抑制作用

3 討論

紅白血病是一種少見的異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于多能干細胞，可以同時累及多個細胞系，臨床預(yù)后較差［4］。大蒜素中含有的硫化物、微量元素、超氧化物歧化酶等一些特殊的生物活性物質(zhì)使大蒜素具有廣泛的藥效，尤其具有良好的抗菌消炎和抗腫瘤的作用［5］。近年來國內(nèi)外的流行病學(xué)調(diào)查表明，大蒜素對胃癌、結(jié)腸癌、白血病等多種腫瘤均有抑制作用［6］。研究表明，大蒜素主要通過抑制腫瘤細胞增殖、直接殺傷腫瘤細胞、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期于G1/S期和G2/M期、增強化療藥物的敏感性以及提高機體的免疫力來發(fā)揮抗腫瘤作用［7-9］。

本研究以人紅白血病K562細胞為靶細胞進行大蒜素的抗腫瘤效應(yīng)研究，采用形態(tài)學(xué)觀察、瑞氏染色、MTT比色分析法檢測大蒜素對K562細胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示K562細胞經(jīng)大蒜素處理后，試驗組與對照組相比，細胞明顯減少、分散，體積縮小，胞漿濃縮，顆粒增多;經(jīng)瑞氏染色后，胞質(zhì)濃染，結(jié)構(gòu)模糊，邊緣不清晰，核固縮、深染，可見凋亡小體和細胞碎屑，胞漿中出現(xiàn)空泡。MTT比色法證實大蒜素對體外培養(yǎng)的K562細胞有明顯的生長抑制作用，且具有劑量和時間依賴性，即隨著大蒜素濃度的升高和作用時間的延長，K562細胞存活率降低，抑制率顯著升高。綜上所述，大蒜素對K562細胞有生長抑制作用，能誘導(dǎo)K562細胞凋亡。

近年來白血病發(fā)病率呈上升趨勢，目前對白血病的治療主要是強效化療，然而化療藥物在殺傷白血病細胞的同時也殺傷骨髓中正常的造血干祖細胞，導(dǎo)致骨髓抑制與粒細胞缺乏而發(fā)生各種嚴重感染［6］。由于耐藥性增加，副作用明顯，用藥效果差，最終使化療無效。因此開發(fā)一種高效低毒的抗癌新藥對白血病的臨床治療意義重大。本試驗通過大蒜素在體外抑制K562細胞生長并誘導(dǎo)凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素不僅具有抗腫瘤效應(yīng)，還具有天然安全的特點，可用于白血病患者的輔助治療，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，為進入臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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