周權(quán)明，章加寬，張 思，劉 俊，徐 寧，劉冠苗，簡(jiǎn)秋林，楊淑艷 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.臨床醫(yī)學(xué)院，2.病理教研室，吉林 吉林 3203)

肝缺血再灌注是創(chuàng)傷性休克、肝臟外科等常見的病理生理過程，它不僅引起肝臟本身的功能障礙，還可導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官腎臟的損傷，造成腎功能不全，嚴(yán)重影響病人手術(shù)后的生存率和愈后的生活質(zhì)量，因此防治肝缺血再灌注后腎損傷具有重要臨床意義。本研究通過復(fù)制大鼠肝缺血再灌注的腎損傷動(dòng)物模型，探討燈盞花素對(duì)肝缺血再灌注后腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用燈盞花素防治肝缺血再灌注后腎損傷提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑和儀器

燈盞花素液(山西石藥銀湖制藥有限責(zé)任公司，11011231)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及髓過氧化物酶(MPO)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物醫(yī)藥研究所。BA300型數(shù)碼生物顯微鏡(中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);RM2126型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);ZMN-7803型全自動(dòng)組織包埋機(jī)(常州市華利電子有限公司);TD-5A型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海金鵬科學(xué)儀器有限公司);AG135電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京醫(yī)療設(shè)備廠);772可見分光光度計(jì)(上海菁華儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模

Wistar雌性大鼠40只，體重(210±20)g，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)SCXK-(吉)2007-2003。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成4組，即假手術(shù)組、模型組、燈盞花素低劑量組和燈盞花素高劑量組，每組10只。

造模前，燈盞花素低、高劑量組每天分別腹腔注射燈盞花素液10 mg/(kg·d)和20 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組每天腹腔注射等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，各組動(dòng)物于手術(shù)前禁食不禁水12 h以上，腹腔注射10%的水合氯醛0.3 mL/kg進(jìn)行麻醉，沿腹正中線開腹暴露肝門后，假手術(shù)組只開腹暴露肝門，不做其他處理，模型組，燈盞花素低、高劑量組于尾狀葉上方游離肝左葉、中葉、右中葉的血管及膽管，用無(wú)損傷鉗夾閉，造成肝缺血30 min后，松夾重新灌注60 min，造成肝缺血再灌注腎損傷動(dòng)物模型。

1.3 標(biāo)本采集

于再灌注60 min時(shí)，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，取左腎以10%福爾馬林固定，取右腎制成5%的勻漿(即取100 mg腎組織，用眼科手術(shù)剪將其剪碎，加入2 mL勻漿介質(zhì)液)后，以3 000 r/min離心10 min，輕輕吸取適量上清液，-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

腎組織病理學(xué)檢查:固定好的腎經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

腎組織勻漿MDA、SOD、MPO的測(cè)定:將制備好的勻漿嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)學(xué)Spss13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對(duì)大鼠腎組織病理學(xué)變化的影響

假手術(shù)組腎組織中腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見組織細(xì)胞水腫及壞死現(xiàn)象;模型組腎小球毛細(xì)血管及腎間質(zhì)充血，伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎近曲小管上皮細(xì)胞明顯水腫，有少數(shù)細(xì)胞壞死，致使腎小管管腔不規(guī)則、狹窄;燈盞花素低、高劑量組腎小球毛細(xì)血管及腎間質(zhì)輕度充血，無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎近曲小管上皮細(xì)胞輕度水腫，無(wú)明顯細(xì)胞壞死，腎小管管腔無(wú)明顯狹窄，較規(guī)則，腎損傷改變較模型組明顯減輕，兩組無(wú)明顯差異。結(jié)果見圖1。

2.2 燈盞花素對(duì)大鼠腎組織勻漿MDA含量、SOD、MPO的影響

與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性降低，差異顯著(P＜0.01)，MDA含量升高(P＜0.05)，MPO活性升高(P＜0.05);與模型組比較，燈盞花素低、高劑量組SOD活性升高(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.05)，MPO降低(P＜0.05或P＜0.01);與低劑量燈盞花素組比較，高劑量燈盞花素組SOD、MDA、MPO無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

圖1 燈盞花素對(duì)大鼠腎組織病理學(xué)變化的影響

表1 燈盞花素對(duì)大鼠腎勻漿MDA、SOD和MPO的影響(±S，n=10)

表1 燈盞花素對(duì)大鼠腎勻漿MDA、SOD和MPO的影響(±S，n=10)

與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別SOD(U/mgprot)MDA(μmol/gprot)MPO(U/g)假手術(shù)組 241±3＊＊ 4.1±0.7* 4.3±0.7*模型組 212±15 4.8±0.5 8.9±1.1低劑量組 236±9* 3.7±0.6* 6.6±1.4*高劑量組 235±10＊＊ 3.2±0.9* 6.1±0.9＊＊

3 討論

肝缺血再灌注所致腎損傷的發(fā)生機(jī)制未完全闡明，主要與氧自由基、白細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子等作用有關(guān)［1-2］。本研究通過復(fù)制大鼠肝缺血再灌注后腎損傷動(dòng)物模型，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管及腎間質(zhì)充血，腎小管上皮細(xì)胞水腫，少數(shù)細(xì)胞壞死，說明肝缺血再灌注后可導(dǎo)致腎組織發(fā)生損傷。與模型組比較，燈盞花素低、高劑量組腎組織病理變化明顯減輕，提示燈盞花素對(duì)肝缺血再灌注后腎損傷具有保護(hù)作用。

燈盞花素是從中藥燈盞花中提取的黃酮類有效成分，能夠改善微循環(huán)、清除自由基、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制中性粒細(xì)胞聚集等作用［3-7］。MPO是存在于中性粒細(xì)胞內(nèi)的一種酶，它是中性粒細(xì)胞在組織中聚集程度的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織MPO明顯增加，MDA含量明顯升高，而SOD活性明顯降低;與模型組比較，燈盞花素低、高劑量組大鼠MPO明顯降低，MDA含量明顯降低，SOD活性明顯升高，兩組無(wú)明顯差異，這說明燈盞花素對(duì)大鼠肝缺血再灌注后腎損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是抑制中性粒細(xì)胞聚集、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高機(jī)體的抗氧化作用有關(guān)，但其詳細(xì)作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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