譚 巖 王永晨 白 曉 蘆小單 方艷秋 (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實驗中心，長春 130021)

黑色素細(xì)胞癌(Malignantmelanoma)是由黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而形成的，具有高侵襲、高轉(zhuǎn)移的特性。惡性黑色素瘤因其持續(xù)增長的發(fā)病率和死亡率日益受到人們的重視，其發(fā)病率在近二十年中成倍增長［1］。據(jù)統(tǒng)計，惡性黑色素瘤發(fā)病率占全部惡性腫瘤的3%，占皮膚惡性腫瘤的7% ～20%，其發(fā)病率年平均增長速度為4% ～6%［2］。惡性黑色素瘤可由先天性良性黑色素細(xì)胞痣演變而成，或是由發(fā)育不良性痣惡變而來，也可以是新發(fā)生的，而由藍(lán)痣或其他皮膚樹突狀細(xì)胞吞噬小節(jié)演變而成的極為罕見［3］。Fas是腫瘤壞死因子受體家族的成員，又稱為Apo-1/CD95，是Ⅰ型跨膜受體蛋白。細(xì)胞膜上表達(dá)的Fas與其配體FasL作用，傳遞細(xì)胞凋亡信號。Fas/FasL在腫瘤中的作用機(jī)制被重視和廣泛研究?？扇苄訤as(soluble Fas，sFas)是缺少Fas跨膜結(jié)構(gòu)域的一種剪接體，也因此能夠分泌到循環(huán)系統(tǒng)中。有研究者認(rèn)為，sFas分子能夠抑制功能性Fas/FasL復(fù)合物形成［4］。目前對于sFas在惡性腫瘤中的表達(dá)報道不一，但多數(shù)研究提示在惡性腫瘤中sFas均有不同程度的增高［5］。本研究對黑色素細(xì)胞癌患者的臨床資料進(jìn)行了回顧性分析，通過ELISA方法對黑色素瘤患者血清sFas水平進(jìn)行比較，探討了sFas在惡性黑色素細(xì)胞癌中過量表達(dá)的意義。

1 材料與方法

1．1 臨床資料

1．1．1 免疫熒光實驗用臨床標(biāo)本 吉林省人民醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(2001～2008年)資料保存完整并經(jīng)臨床病理證實為黑色素瘤患者的石蠟包埋組織。根據(jù)WHO病理分類標(biāo)準(zhǔn)，將標(biāo)本分為4組:MM伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(A組)、MM無轉(zhuǎn)移組(B組)、良性黑色素細(xì)胞痣組(C組)和良性黑色素細(xì)胞痣旁正常組織對照組(D組);各組例數(shù)分別為:A組16例、B組19例、C組2l例、D組28例，共84例，其中男性43例，女性41例，年齡25～70歲，平均52．3歲。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μn厚連續(xù)切片，備免疫組化染色。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)，用于實驗的全部樣本均取得知情同意。

1．1．2 sFas檢測用臨床標(biāo)本 病例資料來源于吉林省人民醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(2001～2008年)，經(jīng)臨床病理證實為黑色素瘤的患者。用于檢測sFas的樣品中，隨機(jī)選擇9例經(jīng)臨床病理證實為MM患者的血清樣本，其中男性3例，女性6例，年齡26～75歲，平均57．89歲，所有患者手術(shù)前均未應(yīng)用放療、化療或免疫制劑;隨機(jī)選擇6例黑色素細(xì)胞痣患者的血清樣本，其中男性3例，女性3例，年齡23～72歲，平均50．17歲;隨機(jī)選擇6例正常健康人血清樣本，其中男性4例，女性2例，年齡26～69歲，平均42．7歲。所有樣本均抽取肘靜脈血2 ml于EDTA的抗凝塑料管中，以1 500 r/min離心20分鐘，分離出血清后存儲于－80℃冰箱中待測。

1．2 試劑 免疫熒光反應(yīng)使用鼠抗人Fas單克隆抗體、兔抗人FasL單克隆抗體(Santa Cruz)，羊抗兔IgG-FITC、羊抗鼠 IgG-Cy3、Hoechst 33342(Sigma)。ELISA實驗使用人sFas ELISA檢測試劑盒(Sigma)。

1．3 方法

1．3．1 免疫熒光實驗 石蠟切片機(jī)切片4μm，70℃烤箱烤片2小時;切片脫蠟;入1% 火棉膠溶液4℃ 15分鐘，梯度酒精至水，覆蓋液處理4℃ 10分鐘，0．1%PBS緩沖液中放置4℃ 1小時;蛋白酶消化5～30分鐘;0．1%PBS緩沖液洗5分鐘×3次;非免疫血清覆蓋30分鐘;標(biāo)記一抗4℃過夜;0.1%PBS緩沖液洗5分鐘×3次;熒光二抗30分鐘，避光;甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。Fas陽性顯現(xiàn)紅色熒光，F(xiàn)asL陽性顯現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核顯現(xiàn)藍(lán)色熒光。

1．3．2 ELISA實驗 用抗人 sFAS/APO-1抗體包被酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的sFas與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人sFas抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492 nm處測OD值，sFas濃度與OD值呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中sFas的濃度。具體實驗步驟:將試劑盒平衡至室溫;建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8個，每孔加入樣品稀釋液100μl，第一孔加入標(biāo)準(zhǔn)品100μl，混勻后用加樣器吸出100μl移至第二孔，如此反復(fù)對倍稀釋至第7孔，第8孔為空白;加樣:每孔加入100μl待測血清;反應(yīng)板置37℃反應(yīng)120分鐘;洗板:用洗滌液反復(fù)洗滌4～6次;每孔加入第一抗體工作液50μl;將反應(yīng)板混勻后置37℃ 60分鐘，洗板;每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100μl;將反應(yīng)板混勻后置37℃ 60分鐘，洗板;每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗處反應(yīng)5～10分鐘;每孔加入50μl終止液;在492 nm處測吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值在Excel中制出半對數(shù)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度設(shè)為X軸，OD值為Y軸，將樣品的OD值帶入公式，計算濃度，比較正常組、黑色素痣組和惡性黑色素瘤組組間差異。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間參數(shù)比較采用t檢驗分析或雙向變異數(shù)分析(Two-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2．1 黑色素細(xì)胞癌組織的病理分析 經(jīng)組織病理分析，35例為黑色素瘤組織，病理分型:淺表型(Superficial spreading melanoma，SSM)2 例、結(jié)節(jié)型(Nodularmelanoma，NM)9例、肢端型(Acral lentiginousmelanoma，ALM)18例、雀斑痣型(Lentigo malignamelanoma，LMM)6例。腫瘤浸潤深度≥0.5 mm占 85．7%(32/35)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的占45.7%(16/35)。Clark分級Ⅰ級3例，Ⅱ級5例，Ⅲ級5例，Ⅳ級12例，Ⅴ級10例。臨床分期1期8例、2期6例、3期9例、4期12例。

2．2 Fas/FasL表達(dá)水平差異比較 用免疫熒光方法對正常皮膚組織，良性黑色素痣組織和黑色素細(xì)胞癌組織中，分析 Fas/FasL表達(dá)水平，結(jié)果以免疫熒光強(qiáng)度的形式進(jìn)行比較，見表1。在正常皮膚組織中，F(xiàn)as熒光強(qiáng)度為581．25 ±164．58，F(xiàn)asL 熒光強(qiáng)度為5．62 ±4．88;在良性黑色素痣組織中，F(xiàn)as熒光強(qiáng)度為410．52 ±239．24，F(xiàn)asL 熒光強(qiáng)度為 88．09 ±86．28;在惡性黑色素細(xì)胞癌組織中，F(xiàn)as熒光強(qiáng)度為119．01 ±117．65，F(xiàn)asL 熒光強(qiáng)度為 438．77 ±321.33。比較各組Fas表達(dá)熒光強(qiáng)度差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．001)，組間兩兩比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，在正常組織中Fas熒光強(qiáng)度最高，其次為黑色素細(xì)胞痣組，惡性黑色素癌組Fas熒光強(qiáng)度最低;比較各組FasL表達(dá)熒光強(qiáng)度有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．001)，組間兩兩比較，正常組和黑色素細(xì)胞痣組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，其余各組兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，F(xiàn)asL熒光強(qiáng)度在惡性黑色素瘤組中最高，其次是黑色素細(xì)胞痣組和正常組織。

表1 不同組織Fas/FasL免疫熒光強(qiáng)度(±s)Tab．1 Flourescence value of Fas/FasL in different type of tissues(±s)

表1 不同組織Fas/FasL免疫熒光強(qiáng)度(±s)Tab．1 Flourescence value of Fas/FasL in different type of tissues(±s)

Flourescence value Groups 581．25 ±164．58 5．62 ±4．88 Melanocytic nevus(n=21) 410．52 ±239．24 88．09 ±86．28 Malignantmelanoma(n=35)Fas FasL Control(n=28)119．01 ±117．65 438．77 ±321．33

圖1 不同組織Fas/FasL免疫熒光強(qiáng)度差異比較Fig．1 Compare of Fas/FasL expression by immunoflourescence

經(jīng)過雙向變異數(shù)分析方法(Two-way ANOVA)進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)各組織中免疫熒光Fas與FasL熒光強(qiáng)度具有顯著性差異(P＜0．001)，見圖1。

圖2 血清中可溶性sFas表達(dá)水平在正常人、良性黑色素痣、惡性黑色素癌患者中的差異Fig．2 Serum soluble Fas expression levels of control，MN and MM

2．3 可溶性sFas在惡性黑色素癌患者體內(nèi)表達(dá)較高 檢測惡性黑色素瘤患者及黑色素痣和正常人血清sFas水平，結(jié)果顯示:正常組sFas濃度為4．18±1．88 ng/ml(n=6)，黑色素痣組 sFas濃度為 7．33 ±3．78 ng/ml(n=6)，惡性黑色素瘤組 sFas濃度為36．32 ±11．57 ng/ml(n=9)，各組數(shù)據(jù)之間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．001)，組間兩兩比較顯示正常對照組和黑色素痣組之間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，惡性黑色素瘤組和其他兩組之間比較的差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．001)，各組中惡性黑色素瘤組血清sFas水平最高(圖2)。

3 討論

Fas/FasL系統(tǒng)在人體適當(dāng)表達(dá)對維持機(jī)體自身平衡發(fā)揮著極其重要的作用，但如果Fas/FasL系統(tǒng)調(diào)節(jié)失調(diào)，則會給人體帶來損害，引起組織增生惡變或組織間相互致死。近幾年來，對Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與腫瘤免疫逃避的研究取得了很大的研究進(jìn)展，提出了Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡障礙是腫瘤形成的重要原因。從對Fas和FasL的分離、鑒定、表達(dá)及功能等的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)在人體細(xì)胞凋亡、免疫逃避及維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡上有重要生理功能，并證明Fas/FasL系統(tǒng)的功能性損傷和惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［6］。本研究通過免疫熒光的方法對惡性黑色素癌組織、黑色素痣組織和正常皮膚組織中Fas、FasL表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Fas在正常皮膚組織中高表達(dá)，惡性黑色素癌組織中低表達(dá);與之相反，F(xiàn)asL在惡性黑色素癌組織中高表達(dá)，在正常皮膚組織中低表達(dá)，說明人體中Fas/FasL的變化與惡性黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展具有相關(guān)性。

sFas可以從細(xì)胞膜分泌或脫落到細(xì)胞外釋放入血液循環(huán)，所以可以在血漿中被檢測出來。有研究表明，無論是造血系統(tǒng)腫瘤還是非造血系統(tǒng)腫瘤，越來越多的腫瘤病人血清中sFas水平升高，提示sFas可能作為一個保護(hù)因子來幫助腫瘤細(xì)胞在宿主的微環(huán)境中逃避凋亡［7-9］。Li等［10］報道了實體惡性腫瘤血清sFas也有升高，推測sFas有望成為反映疾病狀態(tài)、腫瘤負(fù)荷的候選指標(biāo)。Jodo等［5］的研究顯示，若sFas以3．03μg/L為臨界水平，則正常組sFas陽性率為 1．7%，肝硬化組為 25．9%，肝癌組為59.0%，且多發(fā)性病灶的肝癌病人血清中sFas水平明顯高于單發(fā)性的病人。研究者對膀胱癌的研究顯示，病人組的sFas水平明顯高于正常對照組，而且在隨后5年的隨訪中，sFas高水平組的生存率明顯低于低水平組，多因素分析顯示高水平sFas是影響預(yù)后的獨(dú)立的危險因子。其他實驗室陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，sFas在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中也有相似變化，且均與病情變化及預(yù)后有密切聯(lián)系［9］。

本研究通過比較sFas在惡性黑色素瘤、良性黑色素痣和正常人血清中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)正常組和良性黑色素痣組的sFas濃度明顯低于惡性黑色素瘤組sFas濃度，各組中惡性黑色素瘤組血清sFas含量最高。本研究認(rèn)為，血清sFas水平異常增高與惡性黑色素瘤的惡性行為有關(guān)，推測血清sFas水平對惡性黑色素瘤可能具有診斷價值，其可能機(jī)制為:雖然在惡黑中FasL表達(dá)量增加，似乎更有利于Fas與FasL結(jié)合，但一方面此時Fas表達(dá)量較少不利于二者很好結(jié)合，另一方面，在惡黑中sFas表達(dá)增加，使sFas與原本表達(dá)量就不多的Fas相互競爭，與FasL結(jié)合，從而阻斷了Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，使腫瘤細(xì)胞增殖，惡性程度增加。因此，研究惡性黑色素瘤患者sFas水平，來判斷惡性黑色素瘤患者的預(yù)后及腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移情況，以探討其在惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其在術(shù)前或早期診斷的意義，將為惡性黑色素瘤診斷和治療提供更有力的依據(jù)［11-13］。

1 Zhang Q，Wu J，Nguyen A et al．Molecular mechanism underlying differential apoptosis between human melanoma cell lines UACC903 and UACC903(+6)revealed by mitochondria-focused cDNA microarrays［J］．Apoptosis，2008;13(8):993-1004．

2 Bogenrieder T，Herlyn M．Themolecular pathology of cutaneousmelanoma［J］．Cancer Biomark，2010;9(1-6):267-286．

3 Eggermont A M，Robert C．Melanoma in 2011:a new paradigm tumor for drug development［J］．Nat Rev Clin Oncol，2011;9(2):74-76．

4 Hanahan D，Weinberg R A．Hallmarksof cancer:the nextgeneration［J］．Cell，2011;144(5):646-674．

5 Jodo S，Kobayashi S，Nakajima Y etal．Elevated serum levelsof soluble Fas/APO-1(CD95)in patients with hepatocellular carcinoma［J］．Clin Exp Immunol，1998;112(2):166-171．

6 Anastassiou G，Coupland SE，Stang A et al．Expression of Fas and Fas ligand in uvealmelanoma:biological implication and prognostic value［J］．JPathol，2001;194(4):466-472．

7 Balch CM，Soong S J，Gershenwald JE et al．Prognostic factors analysisof17，600melanoma patients:validation of the American Joint Committee on Cancermelanoma staging system ［J］．JClin Oncol，2001;19(16):3622-3634．

8 Matsuki Y，Li L，Hsu H C etal．Soluble Fasgene therapy protectsagainst Fas-mediated apoptosis of hepatocytes but not the lethal effects of Fas-induced TNF-alpha production by Kupffer cells［J］．Cell Death Differ，2002;9(6):626-635．

9 Eberle J，F(xiàn)ecker L F，Hossini AM et al．CD95/Fas signaling in human melanoma cells:conditional expression of CD95L/FasL overcomes the intrinsic apoptosis resistance ofmalignantmelanoma and inhibits growth and progression of human melanoma xenotransplants［J］．Oncogene，2003;22(57):9131-1941．

10 Li C，Larson D，Zhang Z et al．Polymorphisms of the FASand FAS ligand genes associated with risk of cutaneousmalignantmelanoma［J］．Pharmacogenet Genomics，2006;16(4):253-263．

11 Li L H，Wu L J，Jiang Y Y et al．Silymarin enhanced cytotoxic effect of anti-Fas agonistic antibody CH11 on A375-S2 cells［J］．J Asian Nat Prod Res，2007;9(6-8):593-602．

12 王永晨，譚 巖．Fas/FasL及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)與人黑素瘤惡性程度［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2008;88(14):965-968．

13 劉 靜，王永晨．惡性黑色素瘤患者血清可溶性Fas水平變化及臨床意義［J］．中華全科醫(yī)師雜志，2009;8(8):570-571．