羅慶偉，田小林，蔣志慶，林 靜

在世界范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第2位。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌治療失敗和死亡的主要原因，是胃癌最重要的預(yù)后影響因素。約60%的可切除胃癌在確診時已經(jīng)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)展期胃癌總的5年生存率不足20%，但目前的研究對于胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制知之甚少。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌的最主要轉(zhuǎn)移方式及導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)的原因之一［1］，影響著胃癌患者的預(yù)后。腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與淋巴管生成關(guān)系密切，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率即轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)與檢出淋巴結(jié)數(shù)的比值，與患者預(yù)后有相關(guān)性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率升高提示患者預(yù)后較差［2］。podoplanin是一種小分子黏液樣跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，為淋巴管特異性標(biāo)志物，可用以區(qū)分微淋巴管和微血管。本研究采用免疫組化方法檢測患者胃癌組織、癌旁組織及胃正常組織淋巴管podoplanin表達(dá)情況，探討podoplanin在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2009年1月—2010年2月收治的胃癌患者54例，均有完整的病歷資料且經(jīng)病理學(xué)檢查確診;收集其手術(shù)切除的胃癌組織、癌旁組織存檔蠟塊及同期10例健康體檢者的正常胃組織蠟塊作為實(shí)驗(yàn)材料。胃癌組織蠟塊須包含癌中央?yún)^(qū) (癌內(nèi))及胃癌組織與周圍正常組織交界區(qū) (癌周)，且患者術(shù)前未接受過化療。54例胃癌患者中男36例，女18例;年齡30～90歲，平均55.7歲;低分化腺癌18例，中分化腺癌24例，高分化腺癌12例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例;2003年國際抗癌聯(lián)盟 (UICC)胃癌TNM分級:Ⅰ級13例，Ⅱ級18例，Ⅲ級14例，Ⅳ級9例。

1.2 儀器與試劑 Shandon切片機(jī) (型號:Finesse325)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (型號:PHY-DHS-600-B)，OLYMPUS正置熒光顯微鏡 (型號:BX51)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(型號:CH30)，Thermo Electron Finnpipette轉(zhuǎn)移器 (型號:Z46607)，抗podoplanin單克隆抗體 (購自Santa Cruz Biotechnology公司)，免疫組化PV-9000試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒 (購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 免疫組化染色 (1)采用辣根過氧化酶標(biāo)記的SP法，實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)制作石蠟包埋塊并切片，切片厚度為4～6 μm，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽高溫高壓法抗原修復(fù);(2)3%的H2O2室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;(3)磷酸鹽緩沖液 (PBS)沖洗后，滴加抗podoplanin抗體 (1∶100倍稀釋)，4℃冰箱過夜;(4)滴加聚合物輔助劑，室溫孵育20 min，辣根過氧化酶標(biāo)記二抗，室溫處理30 min;(5)用PBS沖洗，DAB顯色，復(fù)染后封片。

1.4 結(jié)果判定與淋巴管計數(shù)方法 podoplanin的著色部位位于細(xì)胞膜。主要表達(dá)于由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成且管壁較薄，外周無周細(xì)胞且無平滑肌的淋巴管，其管腔內(nèi)無紅細(xì)胞，有的管腔內(nèi)可見絮狀物，用400倍視野的光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)判定之后，podoplanin染色陽性的微脈管皆為淋巴管。podoplanin染色陽性標(biāo)記的脈管數(shù)視為微淋巴管密度 (LMVD)。微淋巴管計數(shù)采用Weidner計數(shù)方法［3］，先在低倍鏡 (×40)下確定5個管腔著色最密集的區(qū)域，然后在200倍光鏡下觀察染成棕色的單個細(xì)胞和細(xì)胞叢，并以此作為一個微淋巴管。計數(shù)5個視野的微淋巴管的數(shù)目，取其平均值作為LMVD，癌周淋巴管密度(LMVDpt)定義為距離胃癌組織邊緣100 μm以內(nèi)的周邊區(qū)域內(nèi)podoplanin陽性表達(dá)的微淋巴管數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以 (x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、t'檢驗(yàn)及方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 podoplanin在正常胃組織、胃癌組織、癌旁組織的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示，正常胃組織podoplanin陽性染色微淋巴管在黏膜固有層、黏膜下層、肌層及漿膜層均可見到，在黏膜下層數(shù)目最多，且呈擴(kuò)張狀、壁薄、形態(tài)大小不一。在胃癌組織和癌旁組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞均可見到podoplanin的陽性表達(dá)。胃癌癌細(xì)胞、正常胃組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞對podoplanin免疫組化染色均無反應(yīng) (見圖1～3)。

2.2 胃癌組織、癌旁組織、正常胃組織LMVD的比較 在胃癌組織中，可以觀察到podoplanin染色陽性的淋巴管多位于癌旁組織及胃癌組織中，但數(shù)目及形態(tài)差異性大，癌周微淋巴管數(shù)目多且管腔多擴(kuò)張;而癌內(nèi)微淋巴管數(shù)目少，且多為閉鎖的條索狀，或呈狹長的裂隙狀。podoplanin染色陽性的淋巴管在正常組織中少見。

胃癌組織和癌旁組織的LMVD〔(9.19±2.48)、(18.19±4.22)〕均高于正常胃組織的 (5.60±0.84) (t=4.50，9.34;P＜0.01);癌旁組織的LMVD又高于胃癌組織 (t=13.5，P＜0.01)。同時胃癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LMVD高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，癌旁組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LMVDpt也高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05，見表1)。

圖1 正常胃組織中的淋巴管 (SP，×400)Figure 1 Lymphatic in normal gastric tissues

圖2 胃癌組織中的淋巴管 (SP，×400)Figure 2 Lymphatic in cancerous tissues

圖3 癌旁組織中的淋巴管 (SP，×400)Figure 3 Lymphatic in pericancerous gastric tissues

表1 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌組織及癌旁組織podoplanin表達(dá)情況比較Table 1 Comparison of the expression of podoplanin between cancer tissues and paracancerous tissues with different lymph node metastasis

3 討論

腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的關(guān)鍵問題是淋巴管的識別，因?yàn)榱馨凸茉谛螒B(tài)上與小血管很相似，而腫瘤組織內(nèi)部的淋巴管和血管由于受到腫瘤細(xì)胞的侵襲和破壞使得它們在形態(tài)上更加難以區(qū)別，導(dǎo)致腫瘤淋巴管的研究落后于血管的研究。隨著淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，使得淋巴管更易于觀察識別及與血管進(jìn)行區(qū)分，從而使對腫瘤淋巴管的進(jìn)一步研究成為可能。目前認(rèn)為，比較特異的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物有VEGFR-3、LYVE-1、podoplanin、Prox-1及5'-核苷酸酶等。

podoplanin與腎小球上皮足細(xì)胞扁平化有關(guān)而得名［4］。其是一種相對分子質(zhì)量為38×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，由162個氨基酸構(gòu)成［5］。podoplanin主要表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮上，而在血管內(nèi)皮上不表達(dá)，是淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［6-7］。免疫熒光標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)，97%以上淋巴管均特異性地被podoplanin標(biāo)記［8］。

本研究中，通過免疫組化方法，可以觀察到:podoplanin陽性表達(dá)在管壁較薄且不規(guī)則，管腔較大，通常呈塌陷狀的管道上，內(nèi)無紅細(xì)胞，由核大且向腔內(nèi)突出的單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，這符合毛細(xì)淋巴管的典型形態(tài)特征。淋巴管的這些特點(diǎn)使其更容易被癌細(xì)胞侵襲和破壞。隨著腫瘤體積的增大，瘤周組織內(nèi)淋巴管不同程度的增加，同時瘤組織間隙水腫明顯，導(dǎo)致淋巴管更加擴(kuò)張，使腫瘤細(xì)胞易于通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［9］。淋巴管的生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［10］。關(guān)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前仍不清楚，特別是關(guān)于胃癌組織中淋巴管的數(shù)量、密度是否增加，是否存在淋巴管的新生等問題仍存在較大爭議。

本研究通過對54例胃癌的研究發(fā)現(xiàn)，癌旁組織的LMVD明顯高于胃癌組織。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的胃癌組織及癌旁胃組織的LMVD分別明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的胃癌組織及癌旁胃組織。正常胃組織的LMVD明顯低于胃癌組織和癌旁組織。

本研究表明，微淋巴管的“熱點(diǎn)”區(qū)域絕大多數(shù)位于癌周邊部;癌周組織中的淋巴管的密度明顯增加，尤其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中增加更為明顯。認(rèn)為可能是兩方面的原因引起的:(1)癌細(xì)胞產(chǎn)生大量的淋巴管生成因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (VEGF)-A、VEGF-C、VEGF-D刺激淋巴管的生成，其VEGF-A通過表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體 (VEGFR)-2介導(dǎo)淋巴管生成［11］。VEGF-C、VEGF-D通過旁分泌機(jī)制與腫瘤周圍間質(zhì)內(nèi)或存在于原有淋巴管內(nèi)皮的VEGFR-3結(jié)合，誘導(dǎo)VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致新的淋巴管生成以及原有淋巴管的分支和出芽，造成了淋巴管數(shù)量和密度的增加［12］。(2)腫瘤細(xì)胞自身能分泌促淋巴管生成蛋白podoplanin，促進(jìn)腫瘤性淋巴管新生，從而促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［13-15］。本研究中podoplanin在胃癌中的表達(dá)，可能參與了胃癌組織及癌旁內(nèi)淋巴管的形成。癌細(xì)胞由這些增多的淋巴管向外播散和轉(zhuǎn)移，這可能是癌細(xì)胞沿淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。同時，podoplanin也可作為腫瘤細(xì)胞的血小板聚集介導(dǎo)因子［16-18］而發(fā)揮作用，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及增加腫瘤細(xì)胞侵襲力。已有研究表明，用podoplanin評估口腔鱗癌［19］、食管癌［20］的淋巴管生成，可以預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后。腫瘤組織的LMVD可從一個側(cè)面反映出腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境狀態(tài)，對腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。通過抑制和阻斷podoplanin的表達(dá)，減少新生淋巴管形成，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移成為新的治療思路。

綜上所述，podoplanin在胃癌組織的表達(dá)，胃癌組織及癌旁的高LMVD增加了胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，在胃癌組織podoplanin是否能做預(yù)測評估還待研究。相信，隨著研究的深入與資料的不斷完善，podoplanin與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的規(guī)律和機(jī)制將被闡明。

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