劉淑歌，賴(lài)德源

微量清蛋白尿是糖尿病腎病 (DN)最早的臨床表現(xiàn)，足細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 (EMT)是導(dǎo)致蛋白尿的一個(gè)重要原因［1］，在 DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起著重要作用［2-4］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能通過(guò)其目的基因snail誘導(dǎo)阿霉素腎病小鼠足細(xì)胞發(fā)生EMT及蛋白尿［5］，在腎臟發(fā)育、腎臟腫瘤［6］中起著重要作用，但Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否參與DN足細(xì)胞損傷目前尚不清楚。本研究通過(guò)觀(guān)察活化的βcatenin分子在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT過(guò)程中的表達(dá)，探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，雌性，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):4407208043，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SCXK(粵)2011-0029。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基 (Gibco，USA)，RPMI 1640無(wú)糖培養(yǎng)基 (Gibco，USA)，胰島素 -轉(zhuǎn)鐵蛋白 -硒(ITS) (美國(guó) Gibco)，Anti-Nephrin antibody(Abcom，USA)，Anti-alpha smooth muscle Actin antibody(Abcom，USA)，beta-tubulin(Epitmic)，Non-phospho(Active)βcatenin(Ser33/37/Thr41) (D13A1)Rabbit mAb(CST，USA)，Rabbit polyclonal to Wnt-1(Santa cruz，USA)。其余材料均購(gòu)自中國(guó)威佳公司。

1.3 方法

1.3.1 腎小球足細(xì)胞培養(yǎng)與處理 大鼠脫臼處死后于超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌取出雙腎，去除腎包膜，分離腎皮質(zhì)，依次通過(guò)80目、150目、200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)，收集200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上組織即為腎小球。75 cm2培養(yǎng)瓶預(yù)先鋪Ⅰ型膠原，將收集的腎小球種于培養(yǎng)瓶中，每瓶加完全培養(yǎng)基10 ml，5 d首次換液，7 d傳代，第14天完全分化可用。觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)并采用間接免疫熒光法檢測(cè)nephrin和Wt-1的表達(dá)。為觀(guān)察高糖對(duì)足細(xì)胞EMT的濃度效應(yīng)，設(shè)置正常糖組 (D-葡萄糖5 mmol/L)、高糖組 (D-葡萄糖15 mmol/L、30 mmol/L)，作用48 h;高滲對(duì)照組 (甘露醇25 mmol/L+D-葡萄糖5 mmol/L)。為觀(guān)察高糖對(duì)足細(xì)胞EMT的時(shí)間效應(yīng)，將足細(xì)胞置于30 mmol/L高糖環(huán)境下作用0、12、24、48 h。為了解 Wnt/βcatenin信號(hào)通路是否參與該過(guò)程，檢測(cè)高糖環(huán)境下0、2、4、8、12、24、48 h足細(xì)胞Wnt-1及活化β-catenin的表達(dá)，再將足細(xì)胞置于加入DKK1的高糖培養(yǎng)基作用48 h，檢測(cè)nephrin及α-SMA的表達(dá)。

1.3.2 免疫印跡半定量檢測(cè)nephrin、α-SMA、活化β-catenin及Wnt-1的表達(dá) RIPA裂解緩沖液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。各組取等量上樣蛋白，加入預(yù)先制好的8%的SDS凝膠分離，而后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠 nephrin(1∶200)，α-SMA(1∶200)，β -catenin(1∶1 000)，Wnt-1(1∶200)，4 ℃搖床過(guò)夜。TBST洗滌3次，5 min/次;加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h。超敏發(fā)光液發(fā)光，曝光。β-tubulin作為內(nèi)參照。采用Image J2X軟件分析灰度值。

1.3.3 間接免疫熒光 將各組完全分化的足細(xì)胞按5×104/孔接種于24孔板，至80%融合，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h，48 h后棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%triton-x100破膜8 min，5%牛血清清蛋白 (BSA)常溫封閉1 h，加入一抗nephrin(1∶60)，Wt-1(1∶60)，置于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜;加入異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的熒光二抗，37℃避光1 h;二異丙醇胺 (DIPA)復(fù)染胞核。采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 (x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞原代培養(yǎng) 每只大鼠可收獲7.5×105個(gè)足細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)nephrin以顆粒狀及線(xiàn)狀表達(dá)于足細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)及胞核周?chē)?，Wt-1表達(dá)于胞核 (見(jiàn)圖1)。

2.2 免疫印跡半定量結(jié)果

2.2.1 48 h后，正常糖組nephrin相對(duì)表達(dá)量為 (0.967±0.065)，15 mmol/L高糖組為 (0.771±0.068)，30 mmol/L高糖組為 (0.112±0.042)，高滲對(duì)照組為 (1.096±0.104)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=106.848，P=0.000);正常糖組α-SMA相對(duì)表達(dá)量為 (0.360±0.023)，15 mmol/L高糖組為(0.430±0.008)，30 mmol/L高糖組為 (0.524±0.040)，高滲對(duì)照組為 (0.320±0.030)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=18.149，P=0.001)。足細(xì)胞nephrin和α-SMA的表達(dá)與高糖呈濃度依賴(lài)性 (見(jiàn)圖2)。

2.2.2 30 mmol/L高糖組0 h時(shí)nephrin相對(duì)表達(dá)量為 (0.889±0.039)，12 h時(shí)為 (1.115±0.032)，24 h時(shí)為 (0.782±0.057)，48 h時(shí)為 (0.230±0.003)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=291.463，P=0.000);0 h時(shí) α-SMA相對(duì)表達(dá)量為(0.069±0.006)，12 h時(shí)為 (0.184±0.005)，24 h時(shí)為(0.368±0.019)，48 h時(shí)為 (0.368±0.019)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=528.710，P=0.000)。足細(xì)胞α-SMA的表達(dá)與高糖呈時(shí)間依賴(lài)性 (見(jiàn)圖3)。

2.3 高糖環(huán)境下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路上游分子Wnt-1 0 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量為 (0.028±0.003)，2 h時(shí)為 (0.065±0.005)，4 h時(shí)為 (0.053±0.009)，8 h時(shí)為 (0.082±0.021)，12 h時(shí)為 (0.070±0.010)，24 h時(shí)為 (0.472±0.025)，48 h時(shí)為 (0.338±0.030)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=286.848，P=0.000);Wnt/β-catenin信號(hào)通路中心分子活化β-catenin 0 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量為 (0.002±0.000)，2 h時(shí)為 (0.009±0.005)，4 h時(shí)為 (0.012±0.003)，8 h時(shí)為(0.016±0.002)，12 h時(shí)為 (0.183±0.022)，24 h時(shí)為(0.618±0.036)，48 h時(shí)為 (0.034±0.002)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=593.262，P=0.000)。高糖作用12 h后，足細(xì)胞Wnt-1及活化β-catenin表達(dá)開(kāi)始升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰(見(jiàn)圖4)。

圖1 足細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果 (間接免疫熒光)Figure 1 The results of podocyte primary culture

2.4 正常糖組nephrin相對(duì)表達(dá)量為 (0.885±0.072)，正常糖+DKK1組為 (0.917±0.006)，高糖組為 (0.307±0.015)，高糖 +DKK1組為 (1.693±0.140)，高糖 +BSA組為 (0.273±0.012)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=199.355，P=0.000);正常糖組 α-SMA相對(duì)表達(dá)量為 (0.161±0.005)，正常糖 +DKK1組為 (0.186±0.008)，高糖組為(0.370±0.021)，高糖+DKK1組為 (0.137±0.011)，高糖+BSA組為 (0.389±0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=312.258，P=0.000)。DKK1有助于增加高糖誘導(dǎo)的nephrin的表達(dá)，降低α-SMA的表達(dá) (見(jiàn)圖5)。

圖2 圖2不同糖濃度足細(xì)胞nephrin和α-SMA的表達(dá)Figure 2 Expression of nephrin and α-SMA in podocyte under different glucose concentration

圖3 30 mmol/L高糖組足細(xì)胞nephrin和α-SMA在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)Figure 3 Expression of nephrin and α-SMA in podocyte under 30 mmol/L glucose at different time points

3 討論

足細(xì)胞EMT是近年來(lái)提出的足細(xì)胞損傷的一個(gè)重要機(jī)制，在DN中的作用越來(lái)越受到重視。足細(xì)胞EMT特征性表現(xiàn)是上皮細(xì)胞標(biāo)記物如nephrin表達(dá)降低，而間葉細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA表達(dá)增多。nephrin是一個(gè)重要的腎小球裂孔膜蛋白，在腎小球?yàn)V過(guò)屏障中起著重要作用;α-SMA是肌動(dòng)蛋白家族的成員之一，在正常成年人主要表達(dá)于平滑肌細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，是一個(gè)常用的EMT標(biāo)記物［7］。

圖4 高糖環(huán)境下對(duì)足細(xì)胞Wnt-1及活化β-catenin在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)Figure 4 Expression of Wnt-1 and active β-catenin in podocyte under high glucose at different time points

圖5 DKK1對(duì)足細(xì)胞nephrin及α-SMA蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of DKK1 on the expression of nephrin and α-SMA in podocyte

在各種損傷刺激下，足細(xì)胞根據(jù)遭受損傷的嚴(yán)重性及損傷的持續(xù)時(shí)間發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，包括肥大、去分化、脫落、凋亡［8］。最早足細(xì)胞可能通過(guò)肥大來(lái)代償損失的功能，如果損傷繼續(xù)發(fā)展，足細(xì)胞則發(fā)生EMT從而逃避凋亡，使足細(xì)胞失去高度特異性的上皮細(xì)胞標(biāo)記物，并獲得新的間葉細(xì)胞標(biāo)記物。與腎小管上皮細(xì)胞不同，足細(xì)胞發(fā)生EMT后并非轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，而是獲得了運(yùn)動(dòng)能力，使足細(xì)胞易于從腎小球基底膜脫落，這就導(dǎo)致足細(xì)胞濾過(guò)屏障的功能不全及蛋白尿的產(chǎn)生。隨著機(jī)體損傷程度的加重或損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，足細(xì)胞逐漸發(fā)生凋亡或丟失，從而加劇蛋白尿并導(dǎo)致腎小球硬化。本研究結(jié)果顯示，15 mmol/L和30 mmol/L高糖組48 h后足細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)記物nephrin表達(dá)逐漸降低，間葉細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA表達(dá)逐漸增加，說(shuō)明在高糖作用下足細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是一個(gè)可逆的過(guò)程，早期給予合理干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞損傷［9］，深入了解足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制具有非常重要的意義。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎臟發(fā)育中起重要作用，但在成熟腎臟Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于靜止?fàn)顟B(tài)，幾乎檢測(cè)不到［10］。病理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可重新活化，參與許多慢性腎臟病的發(fā)生，如多囊腎［11］、腎臟腫瘤［6］、腎臟間質(zhì)纖維化及蛋白尿等［5，12-17］。在單側(cè)輸尿管梗阻 (UUO)模型中，腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)Wnt-4蛋白增多，胞質(zhì)中去磷酸化β-catenin增多，目的基因Twist等表達(dá)上調(diào)，腎小管上皮細(xì)胞逐漸失去ZO-1、E-Cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)記物，重新獲得間葉細(xì)胞標(biāo)記物，如α-SMA、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(FSP-1)等，細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原纖維增多［15］。對(duì)鏈脲佐菌素 (STZ)大鼠、db/db小鼠、AKtia小鼠DN模型的研究均表明，在DN中有Wnt信號(hào)通路的過(guò)度活化［16］;有臨床研究表明，DN患者足細(xì)胞FSP-1表達(dá)增多，且FSP-1陽(yáng)性的足細(xì)胞數(shù)目與DN蛋白尿的程度呈正相關(guān)［3］;DN患者病理切片可見(jiàn)足細(xì)胞Wnt-1表達(dá)增高，伴隨著nephrin表達(dá)的降低［6］，說(shuō)明在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中普遍存在Wnt/βcatenin信號(hào)通路的活化。本研究結(jié)果顯示，高糖作用12 h后，足細(xì)胞Wnt-1及活化β-catenin表達(dá)開(kāi)始升高，于24 h時(shí)到達(dá)高峰，48 h后開(kāi)始下降，提示高糖環(huán)境促使足細(xì)胞Wnt/βcatenin信號(hào)通路活化。DKK1可與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的共輔助受體低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5/6結(jié)合，阻斷Wnt信號(hào)通路，是該通路的一個(gè)特異性抑制劑。既往研究表明，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路能減輕腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化［13］，逆轉(zhuǎn)阿霉素腎病小鼠模型中足細(xì)胞的損傷，減輕蛋白尿［18］。本研究結(jié)果顯示，DKK1對(duì)正常糖作用下的足細(xì)胞表型無(wú)明顯影響，但有助于增加高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞nephrin的表達(dá)，降低α-SMA的表達(dá)，提示阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路有可能成為DN治療的一個(gè)新的方向。但本研究為體外實(shí)驗(yàn)，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路能否改善或逆轉(zhuǎn)DN患者的足細(xì)胞損傷、DKK1是否可以作為DN治療的新手段等仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，高糖可誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)的足細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參與了該過(guò)程。進(jìn)一步深入研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路與足細(xì)胞EMT之間的關(guān)系將有助于為扭轉(zhuǎn)DN早期足細(xì)胞損傷提供依據(jù)，為其治療提供一個(gè)新方向。

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