周柯鑫 陳曉衍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

參芪扶正注射液對小鼠腋下種植瘤及肝轉(zhuǎn)移灶的影響

周柯鑫 陳曉衍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

參芪扶正注射液；小鼠；腋下種植瘤；肝轉(zhuǎn)移灶

參芪扶正注射液是一種免疫功能調(diào)節(jié)劑，對化療藥物有顯著的增效減毒作用，其作用機理一直受到醫(yī)藥界的高度重視。目前正在進行作用靶標的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究。

由于參芪扶正注射液是一種多效應(yīng)的物質(zhì)庫，所以，本藥效價將體現(xiàn)中藥復(fù)方多靶點、多層次的作用特點，這給本藥的機理研究帶來一定的難點和熱點。本實驗就不同的治療干預(yù)方案，深入研究腫瘤細胞的病理學(xué)變化特點，從而尋找參芪扶正注射液的作用靶位。

1 材料與方法

表1 小鼠皮下種植瘤生長情況（g、cm）

1.1 材料

①小鼠：小鼠為4～6周齡體質(zhì)量20～24g的雄性BALB/C小鼠（由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供），在II級動物實驗室飼養(yǎng)。②細胞液：選用小鼠結(jié)腸癌C26細胞株（美國引進，廣安門醫(yī)院腫瘤實驗室惠贈）。經(jīng)3次皮下接種傳代后，無菌條件下摘取瘤體，生理鹽水洗滌，剪成小塊，勻漿，離心后取沉淀，反復(fù)3次，培養(yǎng)于10%新生牛血清和RPMI1640培養(yǎng)液（含青霉素100單位/mL、鏈霉素100單位/mL），置37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中3天，每日換液。將細胞液機械吹打成單個細胞，離心取沉淀，加生理鹽水調(diào)整細胞濃度為6 ×105/mL，觀察細胞活力＞95%，備用。③光鏡：Leica公司生產(chǎn)（德國制造）。TYPE：020-519.511 DM LB 100T。④電鏡：天美科技有限公司（日本制造）。TYPE：日立H-7650。⑤參芪扶正注射液（濃縮液）：麗珠集團利民制藥廠提供。⑥5-氟脲嘧啶（5-Fu）：上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號060402。

1.2 分組

取小鼠16只，分為皮下注射和脾內(nèi)注射兩組，每組8只。又隨機分為4組，每組2只。①參芪扶正注射液組（簡稱參芪組）。②5-Fu化療組（簡稱化療組）。③參芪扶正注射液+5-Fu組（簡稱聯(lián)合組）。④造模后未予治療組（簡稱對照組）。

1.3 動物造模

①皮下注射：注射區(qū)常規(guī)消毒后，將0.2mL瘤細胞液注射于小鼠右腋下皮下。②脾內(nèi)注射：小鼠稱重，以0.5%戊巴比妥鈉（50mg/ kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，3～5min后麻醉成功，取左側(cè)腋后線肋緣下縱行切口，長約0.5～1cm，安爾碘皮膚消毒，進腹后于腹外側(cè)找到柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用1mL注射器從脾下極進針，將瘤細胞液0.2mL注射于脾內(nèi)，拔針后，酒精棉球壓迫注射部位1～2min，0號絲線依次間斷縫合肌肉、皮膚關(guān)腹。術(shù)后繼續(xù)在II級動物實驗室飼養(yǎng)。

1.4 干預(yù)治療

①參芪組和聯(lián)合組造模5d后，給予參芪扶正注射液0.15mL（相當于生藥160mg，為成人用量的12倍），加生理鹽水稀釋至0.5mL，腹腔內(nèi)注射，隔日一次，共5次。②化療組和聯(lián)合組造模5d后，給予5-Fu 0.02mL（0.5mg），加生理鹽水稀釋至0.2mL，腹腔內(nèi)注射，隔日一次，共3次。

小鼠造模后自由進食水，每日每只小鼠給生瓜子約1g，每日記錄體質(zhì)量及活動情況。

1.5 取材及標本制備

①皮下注射造模組：造模前每只小鼠稱重。造模后25d，脫頸椎處死小鼠，稱重。常規(guī)消毒后取右腋下切口約2cm，打開皮膚后見色灰白瘤體，表面血管豐富，中間有軟化灶，邊界清楚，將瘤體完整取下，用游標卡尺測瘤體長徑、寬徑；用電子秤稱重，取0.2cm直徑標本放入電鏡固定液中，其余放入10%甲醛固定，備用。②脾內(nèi)注射造模組：造模前每只小鼠稱重。造模后13d，脫頸椎處死小鼠，稱重。常規(guī)消毒后取腹正中切口約3cm。進腹后找到肝臟，肉眼觀察肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)移癌情況，可見肝臟各葉散在轉(zhuǎn)移灶，大者米粒大小，小者如針眼大。取最大轉(zhuǎn)移灶，用游標卡尺測長徑、寬徑，用電子秤稱重。取0.2cm直徑放入電鏡固定液，其余瘤體連同部分周圍肝組織放入10%甲醛固定，備用。

表2 小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤生長情況（g、cm）

表3 各組瘤體切片光鏡下改變

2 結(jié) 果

2.1 小鼠瘤體生長情況

①皮下注射組小鼠瘤體生長情況，見表1。②脾內(nèi)注射組肝轉(zhuǎn)移瘤生長情況，見表2。

2.2 病理學(xué)改變

①光鏡檢查：光鏡下觀察各組小鼠腫瘤細胞形態(tài)、核分裂像數(shù)目、瘤細胞壞死面積、癌周淋巴細胞及中性粒細胞數(shù)量、轉(zhuǎn)移瘤周圍肝臟組織變性壞死情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化療組腫瘤壞死面積大，肝臟組織變性壞死較重，而參芪組和聯(lián)合組壞死程度較輕，其他未見明顯差異（表3）。因樣本數(shù)較小，無統(tǒng)計學(xué)意義。②透射電鏡：超微結(jié)構(gòu)變化如下：癌細胞核染色質(zhì)凝聚，部分呈微篩孔改變。細胞膜內(nèi)陷，線粒體數(shù)量明顯減少，多數(shù)腫脹，嵴減少或斷裂，甚至消失，有不同程度的變性，部分線粒體呈空泡狀。參芪組細胞破壞較輕。見圖1。

3 討 論

3.1 小鼠瘤體生長和轉(zhuǎn)移情況

①皮下注射組小鼠造模后25d處死。4組小鼠體質(zhì)量有明顯差異，參芪組和對照組較造模前體質(zhì)量略有增加，平均增加1.36g；化療組和聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量明顯降低，化療組平均每只下降3.3g、聯(lián)合組平均下降2.55g；各組瘤重差距不明顯，參芪組瘤重平均6.35g，化療組平均5.15g、聯(lián)合組平均6.3g、對照組平均6.49g。由表1所見，參芪扶正注射液對小鼠有一定的保護作用，與化療組對比，荷瘤小鼠體質(zhì)量無下降，瘤重較化療組為輕，自然生長狀態(tài)較活躍。②肝轉(zhuǎn)移瘤情況：8只小鼠脾內(nèi)注射C26癌株，但未切脾。脾內(nèi)種植瘤生長迅速，小鼠生存期較短，種植后13天即處于瀕死狀態(tài)。本組小鼠均發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，其中全部聯(lián)合組小鼠、部分參芪組較化療組肝轉(zhuǎn)移瘤體較小，無法單獨稱重，說明參芪扶正注射液有一定的抑制肝轉(zhuǎn)移的作用。

圖1 6號電鏡

3.2 病理學(xué)檢查

送檢各組小鼠進行光鏡及電鏡檢查。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)化療組腫瘤壞死面積較大，肝臟組織壞死變性較重，而參芪組和聯(lián)合組細胞破壞情況較輕；電鏡觀察癌細胞中單位體積細胞質(zhì)中線粒體的膜面積和數(shù)目明顯減少，但參芪組線粒體膜面積和數(shù)目減少較其他組程度輕，說明參芪扶正注射液對機體組織有一定的保護作用。因樣本數(shù)較少，尚需進一步深入研究。

R735.7

：B

：1671-8194（2013）10-0075-03