廖利民，林淑芳，田凌，陳愛明，林毅

華僑大學化工學院生物工程與技術(shù)系，福建廈門 361021

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性菌[1]。Bt 是目前研究最清楚、應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑。自1901年發(fā)現(xiàn)Bt 到現(xiàn)在的100多年里，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Bt 對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等的多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物等具有特異性毒殺活性[2-3]。因其具有廣泛的殺蟲活性，且對人畜安全、對環(huán)境無毒害，蘇云金芽胞桿菌是目前世界上應(yīng)用最廣泛、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑。

Bt 在其形成芽胞的過程當中，會伴有蛋白晶體的形成，稱伴胞晶體[4]，伴胞晶體是毒殺昆蟲的主要活性物質(zhì)，并且是在Bt 芽胞形成期合成并累積而成。當Bt 芽胞成熟以后，細胞自溶，釋放出芽胞和伴胞晶體，伴胞晶體在昆蟲中腸內(nèi)溶解被轉(zhuǎn)化為δ-內(nèi)毒素(也稱晶體蛋白，Cry)。并與特異性受體高親和性結(jié)合，快速而不可逆地插入細胞質(zhì)膜，形成細胞穿孔，通過膠體滲透裂解將細胞膨脹并裂解，最后導致昆蟲因敗血癥死亡[5-6]。

近年來研究人員通過深入研究發(fā)現(xiàn)自然界中分布更多的是沒有殺蟲活性的Bt 菌株[7]。因此，一些研究人員對伴胞晶體蛋白的非殺蟲活性進行了研究，Yudina 等[8]發(fā)現(xiàn)有些Bt 菌株的伴胞晶體蛋白具有抗菌作用。1999年，日本學者Mizuki 等[9]首先發(fā)現(xiàn)沒有殺蟲活性的Bt 菌株A1190所含的81 kDa 伴胞晶體蛋白經(jīng)蛋白酶處理激活后對體外培養(yǎng)的人白血病T 細胞MOLT-4以及人子宮頸癌細胞具有殺傷力而表現(xiàn)溶血作用。此類伴胞晶體蛋白，因其不會產(chǎn)生溶血作用但可優(yōu)先殺死癌細胞，統(tǒng)稱為Parasporin (簡稱PS)[10]。截止目前，已經(jīng)分離、鑒定出了6種Parasporin 蛋白(Parasporin-1、Parasporin-2、Parasporin-3、 Parasporin-4、 Parasporin-5和Parasporin-6)，分別從6種獨立的 Bt 菌株(A1190、A1547、A1462、A1470、A1100和M019)分離純化而來[11-13]。Kitada 等[14]對Parasporin-2抗人體肝癌細胞的機理進行了研究，發(fā)現(xiàn)Parasporin-2在作用于腫瘤細胞的時候，需要GPI錨定蛋白協(xié)助才能發(fā)揮其抗癌作用。Krishnan等[15]研究發(fā)現(xiàn)Parasoprin-2作用于腫瘤細胞時，腫瘤細胞質(zhì)膜上的磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)可能作為Parasporin-2的受體。Akiba 等[16]通過對Parasporin-2的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，Parasporin-2的分子大小約為37 kDa，經(jīng)蛋白激酶K 處理后具備有抗癌活性，此時Parasoprin-2分子從縱軸上可以分成3個結(jié)構(gòu)域，且發(fā)現(xiàn)其第1個結(jié)構(gòu)域上暴露出來的芳香族氨基酸殘基很有可能是靶細胞質(zhì)膜受體結(jié)合的位點，而這些受體可能是細胞質(zhì)膜上面的膜蛋白糖鏈，也可能是細胞質(zhì)膜上的脂筏所聚集的磷脂。為探討Ⅱ型抗癌晶體蛋白的結(jié)構(gòu)與其抗癌活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們通過對Parasporin-2的人工誘變，產(chǎn)生不同的Parasporin-2的突變體，經(jīng)表達分離純化后測得其各自抗癌活性數(shù)據(jù)。本實驗室之前通過突變體與其受體分子的對接研究，發(fā)現(xiàn)位于第49、51、52、55-60、194和205-212上的氨基酸殘基特別是芳香族氨基酸在突變體和受體之間的相互作用中起著重要作用[17]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過人工模擬突變等方法進一步將Parasporin-2上與其抗肝癌活性密切相關(guān)的氨基酸定位于位點52、56、58和208上，從而為伴胞晶體蛋白抗肝癌活性的理性改造提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌JM110與大腸桿菌BL21(DE3)均由本實驗室保存提供；含有Parasporin-2片段的XL10-gold-Parasporin-2的大腸桿菌由本實驗室保存提供。大腸桿菌高效表達載體 pET-21b(Ampr)由本實驗室保存提供。

1.1.2 細胞

本實驗所用人肝癌細胞SMMC721、Bel7402以及人正常肝細胞Chang-liver 均由廈門華僑亞熱帶植物引種園保存提供。

1.1.3 培養(yǎng)基與抗生素

液體 LB 培養(yǎng)基、固體 LB 培養(yǎng)基；RPMI1640：10%小牛血清，PS 雙抗100 U/mL，5% NaHCO3調(diào)節(jié)pH 至7.2；DMEM：10%小牛血清，PS 雙抗100 U/mL，5% NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.2；抗生素：氨芐青霉素100 mg/mL。

1.1.4 酶與生化試劑

PCR 擴增劑購自廣東東盛生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶及DNA 連接酶購自Invitrogen、NEB 和TaKaRa 公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)公司；Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒購自北京康為生物技術(shù)公司；牛血清蛋白購自Roche 公司；RPMI1640與DEME購自GIBCO/BRL 公司；MTT 購自Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)pET-21b 質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶圖譜和Parasporin-2基因序列，利用Primer5.0輔助設(shè)計引物，引物由廈門英駿生物技術(shù)公司合成：上游：5′-CGCGGATCC GATGGACGTTATTCG-3′(下劃線部分為BamHⅠ位點)；下游：5′-ACGCGTCG AC GGATTCCCCCATTTTG-3′(下劃線部分為SalⅠ位點)。

1.2.2 PCR 模板制備與擴展

從37℃培養(yǎng)12～16 h 的平板上選取1個XL10-gold-Parasporin-2的單菌落，利用堿裂解法提取含有Parasporin-2基因的質(zhì)粒XL10-gold，瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收目標片段，以XL10-gold 為模板，PCR 大量擴增目標片段。

1.2.3 Ⅱ型抗癌晶體蛋白基因的突變

利用5-BU 誘導Parasporin-2基因的隨機誘變PCR，PCR 體系與正常體系相比，添加了1%的5-BU，以XL10-gold 作為模板，進行第一輪擴增誘變。然后以第一輪擴增誘變產(chǎn)物的混合物稀釋50倍作為模板，在含有5-BU 的PCR 體系中重復(fù)進行3次誘變。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與測序

將利用5-BU 誘導的Parasporin-2基因的PCR 誘變得到的DNA 片段用內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切，而后通過T4 DNA 連接酶在16℃、4 h 條件下將目標 DNA 連接到載體pET-21b 上，得到pET21b-P2M 融合重組表達載體。在適量的E.coli 感受態(tài)細胞中加入適量的連接產(chǎn)物，通過熱擊轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導E.coli細胞內(nèi)。長出單菌落后轉(zhuǎn)接于含Amp 平板上，然后進行PCR 檢測篩選陽性克??；同時提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，并通過酶切及PCR 鑒定陽性重組子。將含有陽性重組子質(zhì)粒的E.coli JM110送至廣州英濰捷基公司測序。

1.2.5 融合基因在E.coli BL21(DE3)中誘導表達

挑取新鮮的平板活化的陽性重組子接入5 mL 含有氨芐青霉素與氯霉素的LB 培養(yǎng)基中，同時加入終濃度為1%葡萄糖，37℃、230 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入誘導物IPTG，20℃低溫誘導8～12 h。12000 r/min、4℃離心2 min，收集菌體，超聲破碎，12000 r/min、4℃離心20 min，分別收集上清與沉淀，進行SDS-PAGE 檢測。

1.2.6 鎳柱分離純化蛋白

采用Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒分離純化Parasporin-2突變蛋白，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.7 Parasporin-2及其突變體的抗癌活性檢測

采取MTT 法，收集對數(shù)期細胞，96孔板每孔加入100μL，鋪板使待測細胞密度調(diào)至5000個/孔。5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h 至細胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的藥物(0、6.25、12.5、25、50、75、100μg/mL)，每孔100μL，設(shè)4個復(fù)孔，再培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后在每孔加入20μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后棄去每孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μL DMSO，搖床低速振蕩20 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀在OD570處測量各孔吸光值。同時設(shè)置調(diào)零孔及對照孔。計算IC50值。

1.3 利用生物信息學分析突變體的氨基酸序列與其抗癌活性之間的關(guān)系

1.3.1 Ⅱ型抗癌晶體蛋白的同源建模

利用Discovery Studio 提供的一整套利用Homology Modeling 方法自動預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。DS 的 Homology Modeling 主要基于MODELER 程序。目前MODELER 已經(jīng)成為學術(shù)上使用最為廣泛、預(yù)測最為準確的同源建模工具之一。

1.3.2 Ⅱ型抗癌晶體蛋白突變氨基酸位點的多重響應(yīng)分析

以P2M8氨基酸序列為模板，和其余的8個突變蛋白氨基酸序列進行比對，將有差異的氨基酸位點定義為一個變量，如果該氨基酸和P2M8對應(yīng)的相同，那么這個變量的值就是1，否則變量的值為0。對Ⅱ型抗癌晶體蛋白突變氨基酸位點進行多重響應(yīng)分析。多重相應(yīng)參數(shù)設(shè)置表見表1(以檢測出的抗肝癌活性大小由高到低排列)。

1.3.3 Ⅱ型抗癌晶體蛋白氨基酸能量貢獻的因子分析

利用SPSS17.0軟件，將ODA 預(yù)測出的不同氨基酸的數(shù)據(jù)進行Ⅱ型抗癌晶體蛋白突變氨基酸能量貢獻因子分析。定義為數(shù)值變量，數(shù)值大小為ODA 值的絕對值。

表1 多重響應(yīng)參數(shù)設(shè)置表Table 1 Variation setting of multiple responses

1.3.4 Ⅱ型抗癌晶體蛋白和磷酸甘油酸脫氫酶的ZDOCK 分子對接

利用ZDOCK 軟件，對Ⅱ型抗癌晶體蛋白和磷酸甘油酸脫氫酶進行分子對接分析[17]。

1.3.5 Ⅱ型抗癌晶體模擬突變蛋白和磷酸甘油酸脫氫酶的分子對接

基本操作同前面的ZDOCK 分子對接，只是將參數(shù)“輸入配體蛋白(Input Ligand Protein)”設(shè)定為“人工模擬突變蛋白：人工模擬突變蛋白”。

2 結(jié)果

2.1 Ⅱ型抗癌晶體蛋白基因的PCR 隨機誘變

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明得到一條約864 bp 的擴增帶(圖1)，即為Parasporin-2誘變后活性區(qū)域基因片段，將其命名為P2M。經(jīng)測序后得到9條Parasporin-2的突變基因，其各自的突變位點見表2。

2.2 pET21b-P2M 融合重組表達載體的構(gòu)建

轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到大腸桿菌JM110感受態(tài)細胞中，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆，培養(yǎng)提取質(zhì)粒進行PCR 與酶切鑒定，結(jié)果表明Parasporin-2突變基因已正確克隆進了表達載體(圖2)。

圖1 Parasporin-2基因的PCR 誘變產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of Parasporin-2 PCR mutant product.M:DNA marker;1:PCR mutant product of P2M amplified with PS2F and P2R primers.

2.3 突變蛋白的誘導表達及分離純化

樣品進行超聲破碎后，取上清液進行SDS-PAGE 電泳檢測(圖3)，結(jié)果表明，與未被誘導的對照菌相比，Parasporin-2突變基因能通過表達載體pET21b 在大腸桿菌BL21(DE3)中明顯地表達37 kDa 左右相應(yīng)的蛋白條帶。因Parasporin-2突變基因表達的蛋白帶有6個組氨酸標簽，被鎳柱純化后進行SDS-PAGE 電泳檢測(圖4)，結(jié)果得到與目標條帶一致的37 kDa 左右的條帶。

圖2 重組表達載體pET21b-P2M 的電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of recombinant plasmid pET21b-P2M.M:DNA marker;1:pET21b-P2M digested with BamHⅠand SalⅠ;2:PCR product of recombinant plasmid.

圖3 pET21b-PS2A 誘導表達產(chǎn)物的電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of pET21b-PS2A expressed in E.coli BL21(DE3).M:protein marker;1:without IPTG induced protein of pET21b-P2M;2:IPTG induced protein of pET21b-P2M.

2.4 突變蛋白的抗癌活性檢測

通過MTT法在體外檢測Parasporin-2突變蛋白的細胞毒殺活性。結(jié)果表明不同的突變蛋白對人肝癌細胞的毒殺活性差異很大(表2)，其中P2M1和P2M8對兩種肝癌細胞均存在較強毒殺作用，而不影響正常的肝細胞(圖5)。

2.5 P2M1、P2M8與P2Y 二級結(jié)構(gòu)的比較

以Kabsch-Sander 分類方法進行分類所得到P2M1、P2M8、P2Y 的二級結(jié)構(gòu)如圖6所示。圖中氨基酸序列從上到下依次是 P2Y、P2M1和P2M8，其中紅色橫條表示α螺旋，藍色箭頭表示β折疊，差異氨基酸殘基用著色的方框顯示。

從圖中可以看出在某些位置存在著β折疊、β折疊變長或者是α螺旋的增加等這些二級構(gòu)型的變化都會影響Ⅱ型抗癌晶體蛋白的理化性質(zhì)，最終影響到Ⅱ型抗癌晶體蛋白的抗癌活性。

圖4 鎳柱分離純化 pET21b-PS2A 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of pET21b-P2A purified by Ni-NTA-Agarose.

圖5 P2M1和P2M8在體外對肝癌細胞增殖的作用Fig.5 Effect of P2M1 and P2M8 on the growth of liver cancer cells in vitro.(A,B) Bel7402 and SMMC7721 cells had been treated with different concentrations of P2M1 for 24 h.(C,D) Bel7402 and SMMC7721 cells had been treated with different concentrations of P2M8 for 24 h.The cell viability was determined by MTT assay.

表2 突變蛋白的堿基、氨基酸突變位點及抗SMMC7721、Bel7402腫瘤細胞的IC50Table 2 Mutational sites of bases and amino acids of mutain and their IC50 of anti-SMMC7721 and anti-Bel7402

圖6 P2M1、P2M8和P2Y 的二級結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Secondary structure of P2M1,P2M8 and P2Y.

2.6 Ⅱ型抗癌晶體蛋白突變氨基酸位點的多重響應(yīng)分析

表3給出了多重響應(yīng)變量集位點中有效數(shù)據(jù)和缺失數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計情況，在9個例子中，沒有缺失數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)的有效率是100%。

表4顯示的是多重相應(yīng)分析的頻數(shù)表，其中N 表示的是對應(yīng)位點與P2M8同一位點相比沒有發(fā)生突變的個數(shù)，響應(yīng)百分比表示對應(yīng)位點未突變數(shù)占所有位點未突變數(shù)的百分比，個案百分比表示對應(yīng)位點未突變數(shù)占對應(yīng)位點個數(shù)的百分比；可以看出位點148、158、184和206對蛋白的活性有影響，同時參考變量值設(shè)置表，位點182、203和215對蛋白的活性也有影響。

表3 多重響應(yīng)變量頻數(shù)分析個案摘要表Table 3 Case summary of multiple responses

表4 多重響應(yīng)變量分析頻數(shù)表Table 4 Frequencies of multiple responses

2.7 Ⅱ型抗癌晶體蛋白突變氨基酸能量貢獻因子分析

表5顯示的是Kaiser-Meyer-Olkin (KMO)和Bartlett 的檢驗結(jié)果，其中KMO 值越接近于1越有適合進行因子分析，實驗測得 KMO 值為0.216，表示比較適合做因子分析；Bartlett 球形度檢驗的原假設(shè)為相關(guān)系數(shù)矩陣為單位矩陣，Sig 值為0.000小于顯著水平0.05，因此拒絕原假設(shè)，說明變量之間存在相關(guān)關(guān)系，適合進行因子分析。

表6顯示的是每個變量的共同度的結(jié)果，可以看出因子分析的變量共同度都非常高，表明變量中的大部分信息均能夠被因子所提取，說明因子分析的結(jié)果是有效的。

表5 KMO 和Bartlett 的檢驗表Table 5 KMO and Bartlett’s test

表7顯示的是因子貢獻結(jié)果，該表左側(cè)部分為初始特征值，中間為取主因子結(jié)果，右側(cè)為旋轉(zhuǎn)后的主因子結(jié)果。“Total”是指因子的特征值，“Percent of variance”是指該因子的特征值占總特征值的百分比，“Cumulative percent”是指累積的百分比。從表中可以看出前3個因子的特征值大于1，并且前3個因子的特征值之和占總特征值的94.239%，因此提取這3個因子作為主因子。

圖7是特征值的碎石圖，通常碎石圖顯示的是大因子的陡峭斜率和剩余因子平緩的尾部，之間有明顯的中斷。一般選取主因子在非常陡峭的斜率上而處在平緩斜率上的因子對變異的解釋非常小。從圖中可以看出前3個因子都處在非常陡峭的斜率上，從第4個因子開始斜率變得越來越平緩，因此選擇前3個因子作為主因子。

表6 變量共同度表Table 6 Communalities of variations

表7 解釋的總方差表Table 7 Total variance explained

圖7 碎石圖Fig.7 Scree plot.

三個主因子包含的具體參數(shù)成分如表8所示，可以通過每個參數(shù)的系數(shù)值來判斷分類參數(shù)的貢獻。從表中可以看出，在第1個因子上，色氨酸(W)、組氨酸(H)和酪氨酸(Y)這3類氨基酸的載荷較大，這些氨基酸的支鏈含有苯環(huán)或雜環(huán)；在第2個因子上苯丙氨酸(F)、纈氨酸(V)和色氨酸(W)這3類氨基酸的載荷較大，這些氨基酸的支鏈含有苯環(huán)或甲基；在第3個因子上甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)載荷較大，這些氨基酸要么沒有支鏈要么支鏈含有苯環(huán)?？梢钥闯鲞@3個主因子中涉及到的氨基酸主要為芳香族氨基酸的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。這個結(jié)果和利用ODA 值的算數(shù)權(quán)重的結(jié)果一致，表明色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸在蛋白-蛋白識別過程中發(fā)揮了顯著的作用，這些芳香族氨基酸可能對Parasporin-2的抗肝癌活性有重要的影響。

表8 成分得分系數(shù)表Table 8 Component score coefficient matrix

2.8 人工模擬Ⅱ型抗癌晶體蛋白突變的結(jié)果

通過ODA 預(yù)測蛋白-蛋白結(jié)合最佳識別位點、多重響應(yīng)分析結(jié)果以及因子分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)芳香族氨基酸在蛋白相互識別過程中起著重要作用，同時通過突變體蛋白與Parasporin-2的受體蛋白進行分子對接，還確定在Parasporin-2突變蛋白P2M8上具有活性位點的具體位置分布在位點56、148、158、182、184、203、206和215附近[17]。為此我們進行了模擬突變實驗來驗證這些氨基酸位點及其對應(yīng)的氨基酸。選擇的活性位點附近(具體為53、56、58、208)用色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)替代原來的氨基酸進行模擬突變，得到的結(jié)果如圖8所示。

1號是引入的非芳香族氨基酸，對接結(jié)果表明除了1號外其他的正向模擬突變都比P2M8的分數(shù)好，同時還進行了ODA 預(yù)測，除了1號外其余的模擬突變蛋白的某些氨基酸ODA 值均比對應(yīng)位點的P2M8氨基酸ODA 值更低，表明在人工引入芳香族氨基酸后模擬突變蛋白更容易和受體蛋白結(jié)合。通過模擬突變實驗可以看出Parasporin-2的第52、56、58和208位的氨基酸對其抗肝癌活性有很大的影響。

圖8 模擬突變蛋白與受體的分子對接結(jié)果Fig.8 Docking results between virtual mutants and receptor.

3 討論

本研究構(gòu)建了9個Parasporin-2突變體，測定了其抗肝癌活性，并利用生物信息學軟件進行了較為深入的分析，進而探討了Parasporin-2上與抗肝癌作用相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸。

多重響應(yīng)分析結(jié)果表明Parasporin-2活性區(qū)的第148、158、182、184、203、206和215位氨基酸對其抗肝癌活性有影響，且這些氨基酸主要為色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)。ODA 預(yù)測結(jié)果表明位點49、51、52、55～60、194和205～212的氨基酸殘基和含有苯環(huán)和/或者雜環(huán)的氨基酸對Parasporin-2與受體的結(jié)合中起到了很大的作用。人工模擬突變結(jié)果表明，在位點52、56、58和208位引入色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)對Parasporin-2的抗肝癌活性有正面的影響，上述位點及其附近很有可能是Parasporin-2的抗肝癌活性位點，而芳香族氨基酸色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)在Parasporin-2和受體的結(jié)合中起著重要作用。

本研究結(jié)果在一定程度上揭示了Parasporin-2一級結(jié)構(gòu)與其抗肝癌活性之間的關(guān)系，為今后實施改造提供了依據(jù)。但這些信息對揭示Parasporin-2的結(jié)構(gòu)與其抗肝癌活性之間的關(guān)系還遠遠不夠。今后將測定若干個代表性突變體的晶體結(jié)構(gòu)，深入探討Parasporin-2空間結(jié)構(gòu)上與其抗肝癌活性相關(guān)的特征，為將來實施Parasporin-2的全新設(shè)計提供指導。

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